上篇《NGS悬案 | 样本先生，您带错帽子了》结尾（点击链接，查看上篇精彩内容），我们提到了“一个优秀index的自我修养”，其中包括生产过程的准确性，针对平台的优化，和考虑index的容错性等方面。今天我们就来谈谈，在实际的建库过程中使用的DNA片段链接的接头（adapter），需要具备哪些要素。

illumina的Y型接头是一个公认的聪明又漂亮的设计。自推出以来，仿者众多，虽不尽相同，但异曲同工。随着测序通量的迅速提高和样本通量的相应增加，接头上带有的index序列也在不断变化。从最初的TSLT （low throughput）单端index，变化到TSHT （high throughput）的双端index，以期满足不同混样程度的需求。

然而，随着index hopping（标签跳跃）的问题显露，这些index接头策略显然已不能满足需求。在illumina白皮书中提到的降低index misassigment几条操作里，排在首位的即为Prepare dual indexed library with unique indexes，意思就是采取p5和p7都带有独特的标签，两端交叉检验，去除index misassignment的干扰。

我们一起来看一种新型“3合1”接头结构。这种接头，功能更强大，设计中处处体现了“一个全能接头的自我修养”。

在P5和P7端的蓝色部分为index，且index 1与index 2 为一组特异性搭配的unique dual index（UDI）。P7端绿色部分为Unique Molecular Identifier（UMI）。我们称之为“3合1新型接头”。所谓“3合1”，一方面是指含有P5 index，P7 index和UMI三种元件；另一方面是指同一种接头，有不同的三种应用。三种不同的读取方式，可以行使三种不同的功能。

“3合1”接头最精巧的部分就是P5 index 1和P7 index 2 成组设计。首先，这两个index本身的序列在设计层面上完全满足了我们之前文章提到的“一个优秀index”需要满足的各种因素。其次，两个index 可以进行双重检验，这样可以剔除在各个阶段由于串扰而导致的index misassignment的reads，保证进入最终分析流程的reads可以最接近真实样品。

下图是一种最常用的双端index组合标记DNA片段的index。当时这种index的推出，大大增加了混样的上限。但是实际操作永远不可能尽善尽美，一直存在交叉污染的可能性。

如下图更近一步的解释，我们假设有1% A2接头从A2孔中污染到了A1孔，常规的双端index组合标记的方法最终的文库分子，有1%的错误分配率；而如果采取双端index标记方法，数据分析时，会剔除双端index不匹配文库分子，将index错误分配率降低到0.01%。与之前对比，index misassignment非常可观的降低了两个数量级。

在illumina各种的测序平台 HiSeq 3000/4000，HiSeq X系列以及日前在行业内大火的Novaseq，均运用了ExAmp扩增方式和Patterned flow cell样品槽。新技术的应用使得信号点排布更加规则，扩增效率大大增加，通量更高。但是另一角度来讲，也扩大了游离接头的干扰。

如下图所示，与正确文库分子并不匹配的游离接头在Patterned flow cell中“阴差阳错”作为引物对文库分子进行扩增，使DNA片段标记了游离接头上带有的index，高效的ExAmp扩增方式则迅速的放大了这个错误。

在illumina优化ExAmp技术前，我们只能接受平台的不完美。而“3合1”新型接头巧妙的UDI接头设计，通过在数据分析时进行最终把关，剔除测序扩增过程中由于串扰造成的双端接头不匹配的文库分子，从而很大程度解决测序平台造成的index hopping，降低index错配情况的产生。

正如上述所说，“3合1”是从最终下机的数据进行质控，因此，不管index misassignment发生在哪一意想不到的环节，理论上该策略都可以提供当下最优的解决方案。

综上，如下图所示，“3合1”新型接头的UDI元件，从最终下机的数据进行质控，可以解决NGS整个流程中多个步骤产生的index hopping问题，大大控制了index 错误分配的现象。

带有三个核心元素的新型“3合1接头”功能强大，突出表现在三种不同的读取方式实现三种不同的功能检测。

只需要读取P7端 index，即把“3合1”接头当做普通的illumina Truseq TSLT单端接头来读取信息。这种应用方式适合对样品串扰不敏感的测序，比如遗传病等体细胞层面的突变。

利用“3合1接头”的P5和P7端两个元件，读取两端UDI，进行双侧检验，有效降低index错误分配，防止样品交叉污染。

运用“3合1接头”全部元件，一方面，P7和P5端的UDI设计可以有效降低NGS各个阶段的index misassignment；另一方面利用紧随P7端 index的UMI，可以用于检测低频突变，例如液体活检用户。

UMI实际包含有9nt的随机序列，在片段打断后，连接接头的同时便引入了UMI标签来冻结扩增前的状态，后续利用UMI进行数据分析时，对样本原始状态进行追踪和提取分组。

综上， 新型的“3合1”接头无论在降低index misassignment 方面，还是助力低频检验方面，均具有巨大技术优势。