文章发表在Nature Communications

受限于聚合酶的保真性和测序平台的技术误差，常规NGS平台可稳定检出的灵敏度约为1%VAF，引入双端独特分子标签（dual UMI）技术后这个数值可以提高到 0.01%，但需要的DNA input（起始量）一般比较大，同时还要求进行超高深度测序，大量突变无关序列造成了测序数据量的极大浪费。

UMI技术除了可以矫正系统偏差，还可以通过统计突变分子的family数和样本分子的family总数进行绝对定量。但由于BDA技术大幅度提高了突变分子所占的比例，此时有两种备选定量方案：1）借助无等位基因富集的位点作为阳性内参；2）通过 DNA起始量估算出样本分子的family数。

确定思路后，研究团队首先设计了单重QBDA模拟检测1%VAF水平下同区域9个不同变异的定量情况，与标准NGS方法以及BDA方法相比，QBDA的检测结果最接近期望值（UMI-NGS 方法的结果）。并且QBDA的测序数据中WT reads数只占到2.4%，同时消除了测序过程引入的假突变。

随后，研究团队模拟验证了一个10-plex QBDA panel，排除随机事件因素，QBDA技术在0.1% VAF的水平下的表现依然亮眼。为了进一步挑战低于0.01% VAF水平下QBDA的检测性能以及合理的测序深度，团队设计了包含AML突变热点基因的panel，可以覆盖22个富集区域内的382个碱基位置处发生的变异。结果发现，QBDA在0.005% ~ 0.02%VAF区间的灵敏度为97.9%，使用阴性样本进行重复实验得到特异性为99.95%。此外，浓度梯度实验证实QBDA技术可以区分出 0.02%的VAF差异。

接下来，研究团队使用5名AML患者在诊断期和完全缓解（CR）期的临床样本以比较上述panel和MFC（Multicolor flow cytometry）以及常规NGS技术的检测能力。结果显示，只有QBDA在低于0.01%VAF水平成功检出NPM1突变，并预判了其中一名患者短期内出现的病理复发。常规NGS技术在该患者复发时检出了相同的突变，证明QBDA技术对稀有突变检测的准确性和早期检测的潜力。

最后，研究团队使用了阅尔基因基于QBDA技术开发的VarMap™ Pan-Cancer NGS Panel进行更大规模的验证实验。该产品一共两管，每管180个扩增子，覆盖了61个基因的360个热点区域，仅需50M测序reads即可检出0.01%VAF的变异。如果起始量从1μg减少到10ng，灵敏度依然可达0.1%VAF，测序数据量仅为1M reads。结果显示，在LOD为0.006%VAF水平下，QBDA技术检测20个突变的灵敏度为95%，特异性为99.997%。随后一项包含16个不同类型样本的测试以及针对黑色素瘤患者的变异检测也都观察到了符合临床转归的结果，并且降低了假阳性和假阴性的产生。

在液体活检样本中，可用的DNA量为ng级别，对于检测0.01%VAF突变来说远远不够。在肿瘤组织样本中，来源于福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) DNA的损伤导致的背景突变通常是高于0.1%VAF，因此对于组织DNA或液体活检分析来说，使用低起始量DNA和低测序深度且LOD为0.1%VAF的检测方法比需要高起始量和高测序深度的超灵敏检测方法更为理想。QBDA允许从FFPE和血浆样本中检测低至 0.1%VAF的突变，起始量低至6-20ng，为了解耐药机制和克隆进化以及指导治疗提供了帮助。

研究团队再次使用VarMap™ Pan-Cancer NGS Panel进行低深度测序实验，使用 10ngDNA起始量和每管0.5Mreads，定量大于0.1%的突变，16个样本中（包括多种样本类型）平均每个样本可得到1.9个体细胞突变。接着研究团队使用QBDA 黑色素瘤panel对16个FFPE和7个新鲜冷冻临床样本进行检测，在一个FFPE样本中发现了BRAF V600E和低频NRAS Q61K突变的存在，表明在使用BRAF抑制剂时，共存的低频NRAS突变与潜在的克隆进化和耐药机制相关。因为QBDA技术可以低深度地检测低频突变，在组织或液体活检泛癌种检测中能够直接使用去中心化的测序仪。因此，通过QBDA技术研究团队在Miniseq和Miseq平台中实现了同一个run中测完所有16个样本。

该研究共同通讯作者、阅尔基因美国创新中心负责人、莱斯大学生物工程终身教授 David Zhang表示：“突变VAF的准确定量对于连续监测病人的微小残留病灶（MRD）至关重要。我们的QBDA技术融合了BDA技术的经济性以及UMI定量的准确性。我们相信QBDA将是一股强劲的技术驱动力，帮助实现对癌症患者进行多次、准确且无创的分子检测，从而及时提供并调整潜在的治疗信息。NuProbe致力于开发能够改善肿瘤学诊断、治疗和研究的技术。”