NGS技术的进步加速了基因组学研究的脚步。虽然NGS技术得到了广泛的应用，但许多实验室在NGS文库制备方面仍面临着瓶颈。文库制备前后都需要多个步骤，文库制备前包括DNA提取、定量和片段化，制备后的步骤包括文库质量评估、文库定量和归一化。该过程繁杂，耗时耗力，在一定程度上延误了研究进程。作为液体处理专家，贝克曼库尔特在NGS文库制备流程方面进行了多方面的技术创新。如何实现高通量、低成本的NGS建库？NGS文库中关键Pooling步骤如何提高？此外，对于捕获测序文库制备，贝克曼库尔特又做了哪些努力？下面我们一起来了解一下。
01 单细胞文库构建方案
单细胞测序起始核酸材料极少，步骤比普通NGS繁杂，实验周期更长，难度和风险也更大。而液体处理专家贝克曼库尔特的Echo硬核技术决定它非常适合解决单细胞测序中遇到的超高通量、技术灵活多变、反应scale-down成本控制、交叉污染等问题。
据悉，Echo采用声波能量精准地转移液体，无需接触和使用吸头、喷嘴或导管等工具，喷射液滴单位可以低至2.5nL。同时可实现动态液体分析，通过声能判断液体组成成分、液体高度，进而计算向目标板中转移准确体积所需的能量，实现准确移液。
Echo可以完成常用微量核酸扩增从添加变性剂处理、终止液处理，到Phi29酶恒温扩增等步骤，实现超小体积下的全基因组放大。同时，声波移液还能完成单细胞NGS文库的制备。以SMART-Seq cDNA文库制备为例，利用Echo将SMART-Seq反应体系（50 uL）缩小4，5，8，10，16，20至32倍，Nextera XT 试剂盒缩小10倍（50 uL至5 ul）使用。所有反应均能够获得足够下游上机测序的文库。
图：采用Echo完成的微量化单细胞RNA-seq NGS文库制备流程。
02 IDT文库构建方案
二代测序成本虽然已经下降了几个数量级，但是其样本文库制备的成本仍然高昂，且过程复杂。基于此需求，贝克曼库尔特创新推出Biomek i5+Echo 525超高通量自动化整合系统，可帮助研究人员实现二代测序文库构建中高通量和低成本。
研究团队利用3种不同的微生物样品类型（蜡状芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、红球菌）进行实验，测试了该微量化方法的有效性。Biomek i5+Echo 525 整合系统的微量化文库制备方案可将反应体系缩小20倍，降低每次反应的试剂成本；可单次处理384个样品，提高样品处理通量。该系统完成384个样品的文库制备仅需4小时，该时间包括了试剂分装和孵育。
此外，Echo + Biomek自动化NGS建库方案还具有精准的纳升级至微升级移液技术及自动化处理；向导式软件操作界面和台面自动校对功能；强大的数据追踪系统等特点，以保证研究获得真实结果，减少人为操作失误。
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03 NGS文库Pooling
Pooling是测序文库上机前的临门一脚。Pooling实验通常由两位操作者协作，将文库归一化到一定浓度，将合并测序的文库混合，手工完成归一化和Pooling需耗时长达3小时。现在，采用Echo声波移液系统，12分钟即可完成384个文库Pooling，且不需要密集的吸液移液操作，省时省力。
据介绍，Echo通过聚焦声波能量转移低至2.5nL的样品，不需要吸头，无物理接触。高浓度文库不需额外稀释，可每秒传输几百个液滴实现nL至uL级液滴转移，将浓度归一化和Pooling简化为一步进行。Echo可以微量化反应体系将样品从微孔板任意孔快速转移到目的板任意孔。在基因组学及合成生物学中，可被应用到微量化NGS建库和快速Pooling文库、引物、寡聚核苷酸探针。
图：采用Echo比较384个文库的200nL/文库等体积混样和等摩尔量混样。结果显示经Echo Pooling后文库获得更加均一的测序量。
此外，Echo可关联输入文件，软件自动完成高通量Pooling，并完成384孔甚至1536孔每板的超高通量微量化文库质控定量。文库定量的微量化能够减少试剂消耗，有效控制成本。此外，Echo支持在软件中以表单的形式挑选某些文库做qPCR。整个实验过程数据可循，避免手工操作的窜孔等错误。
图：采用Echo完成文库定量，微量化反应体系至2uL、4uL及8uL绘制校准曲线。
04 捕获测序文库制备
目标区域捕获测序技术可针对目标区域深度测序，增加了检查灵敏度和准确性，既能满足研究需求，又降低了测序成本，在科研、临床中均备受关注。贝克曼库尔特推出的Biomek自动化捕获测序方案，即可帮助实现自动化、标准化的捕获测序。由自动化工作站进行基因捕获，可以减少手工操作时间，提高工作效率，增加结果的重复性和均一性。Biomek工作站可实现从核酸提取、文库构建、定量混样到捕获的整体实验流程。
图：捕获测序文库构建自动化流程。
目前，在Biomek成功自动化的杂交捕获试剂盒包括Agilent、Illumina、NEB、Roche等公司的产品。此外，在Biomek向导式软件操作界面上，用户可以选择样本数量，是否使用台面整合的PCR仪，以及运行工作流程的哪个部分。该系统具备台面自动校对功能，自动判定耗材摆放是否正确并进行提示。
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