传染病是全球第二大死亡原因。病原微生物严重感染患者的尽早检测,对临床干预至关重要。但在临床上:
宏基因组下一代测序(metagenomic next-generation sequencing, mNGS)技术已被证明可以同时从临床样本的游离DNA(cfDNA)中检测多种病原微生物。但因检测方法和样本类型(主要集中在单一的、非化脓性体液类型上)存在很大差异,所以目前很少有研究表明mNGS有明确的临床效果。
基于上述迫切需要解决的问题,美国加州大学旧金山分校与旧金山UCSF-Abbott病毒诊断和发现中心的研究团队开发了一种简单、快速和通用的病原微生物检测方法。研究团队对测序文库进行改进,构建了一种双标签系统(dual-use barcoding system),使构建的文库可同时适用于二代和三代测序平台。结果显示,该方法可利用Illumina和Nanopore测序平台,通过对多种类型体液中cfDNA的mNGS分析快速检测病原微生物,覆盖样本类型可从低细胞性的脊髓液(CSF)到高人类宿主DNA含量的化脓性液体(例如脓肿)。该研究结果已于近日发表在《Nature Medicine》上。
文章发表于Nature Medicine期刊
该研究共收集了160例患者的182份体液样本,包括脓液25份,关节液21份,胸膜液32份,腹膜液27份,脑脊液35份,支气管肺泡灌洗液13份,其他体液29份。
其中,170份样本利用Illumina测序评估mNGS检测的准确性,包括127个培养阳性,9个培养阴性但16S或28S-ITS PCR阳性,以及34个阴性对照。前87个连续收集的样本被用于比较nanopore(Oxford Nanopore Technologies)与Illumina测序的准确性。
剩余的12例体液样本为体液直接微生物检测阴性但高度怀疑或已证实感染的患者。该研究分析了这12个体液样本,以证明mNGS检测在未知感染病因的病原微生物检测中的诊断效用。
该研究中,Illumina和nanopore测序的读取深度中值分别为7.2 M(0.15-35 M)和1.1 M (0.29-6.7 M)。结果显示,经过5小时文库制备后,nanopore测序检测病原微生物中位时间为50分钟(21-320分钟),整个取样到应答周期为6小时,Illumina测序周期为24小时。
图1. mNGS检测的时效,来源:Nature Medicine
mNGS细菌检测结果
针对该研究使用的样本,结果显示,Illumina检测细菌的敏感性和特异性分别为79.2%和90.6%,nanopore检测细菌的敏感性和特异性分别为75.0%和81.4%。
Illumina测序的阳性百分比一致性(PPA)和阴性百分比一致性(NPA)分别为80.0%和95.3%,nanopore测序的PPA和NPA分别81.0%和93.0%。
研究分析发现,除血浆外,mNGS测试的性能在不同的体液类型中总体上是可以比较的,在脑脊液中mNGS检测具有最高的准确性。此外,在检测的微生物中,最常见的漏检微生物是金黄色葡萄球菌。
mNGS真菌检测结果
结果显示,Illumina检测真菌的敏感性和特异性分别为90.6%和89.0%,nanopore检测真菌的敏感性和特异性分别为90.9%和100%。
图2. 体液样品中mNGS检测的准确性及相关病原微生物负荷,来源:Nature Medicine
随后,研究人员评估了体液mNGS在诊断感染方面的潜在临床效用。结果表明,在体液培养和/或PCR检测为阴性的情况下仍有临床可能或已确定感染的12名患者中,mNGS成功鉴定7种病原微生物:产气克雷伯菌、烟曲霉菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、沙柳支孢瓶霉、近平滑假丝酵母和厌氧胃肠道微生物群,并排除了不确定的致病微生物。
通过对mNGS与细菌16S、真菌28S–ITS PCR的比较分析发现,14例病例中有8例mNGS检测结果与PCR结果一致。6例不一致病例中,5例仅可通过mNGS检测发现病原微生物,1例仅通过16S PCR检测发现。其中一个病例为患有坏死性肺炎的免疫缺陷儿童,其胸膜液的16S PCR检测为轻型链球菌,mNGS检测检测为克雷伯肺炎杆菌。随后,研究人员mNGS对克雷伯肺炎杆菌的鉴定通过五种正交方法均得到了验证。其它检测结果不一致的情况,都经过实验验证证实了mNGS鉴定的病原微生物正确。此外,在厌氧细菌和病毒的检测实验中,也证实了mNGS的高准确率。
值得关注的是,研究团队通过比较体液和血浆对mNGS诊断率的差异,发现病原微生物cfDNA负荷在同一病人的局部体液中比血浆中高出160倍。
图3. mNGS与16S(细菌)或28S-ItS(真菌)PCR的比较,来源:Nature Medicine
图4. 成对体液和血浆标本中病原微生物负荷的比较,来源:Nature Medicine
该研究开发了一种利用mNGS从感染患者体液中快速诊断分析病原微生物的方案,该方案获得的总体特异性为83%~100%,其关键特征包括:
1) 可以检测广泛的样本类型;
4) 可利用生物信息学方法自动化分析和解释mNGS数据用于临床验证。
参考文献:
[1] Gu W, Deng X, Lee M, et al. Rapid pathogen detection by metagenomic next-generation sequencing of infected body fluids [published online ahead of print, 2020 Nov 9]. Nat Med. 2020;10.1038/s41591-020-1105-z.
本文由 SEQ.CN 作者:陈初夏 发表,转载请注明来源!