当前，肿瘤个体化治疗已从美好的愿景逐渐步入临床实践。基于分子分型的靶向治疗、免疫治疗等精准治疗手段使肿瘤患者生存期及生活质量得到显著提高。在这一趋势下，以新一代测序（NGS）技术为代表的靶向精准检测方法逐渐从科研实验室走向临床病理科的实际应用中。

2019中国病理年会期间，在罗氏诊断主办的“NGS助力分子病理临床研究专题研讨会”上，我国多位分子病理领域知名专家学者共同探讨了NGS在分子病理诊断中的应用前沿进展。中华医学会病理学分会常委兼秘书长、首都医科大学宣武医院病理科卢德宏教授担任会议主席并表示：“NGS等先进检测技术的发展正推动着病理学科加速变革。进入精准医疗时代，病理学科的重要性愈加凸显，如何充分发挥分子病理等新兴学组的临床价值是我们每一位病理医生需要关注的重点。”

中华医学会病理学分会常委兼秘书长、首都医科大学宣武医院病理科卢德宏教授

“精准医疗要求病理医生掌握患者尽可能详细的信息，包括年龄、性别、基因、既往疾病史、家族谱系、生长环境、生活方式等。个体化差异会影响每位患者的疾病特征，也意味着每个人的疾病预防、诊断和治疗方式可能不同。”苏州大学附属第一医院病理科主任郭凌川教授指出，“现代病理医生的工作不再仅仅是提供一个诊断结果，而是整合所有患者信息给予临床疾病全程管理的指导。”

苏州大学附属第一医院病理科主任郭凌川教授

分子生物学、分子遗传学技术的进步推动着病理诊断从传统的形态学深入至分子层面研究，通过分析肿瘤患者的基因异常情况，包括常见的基因扩增、染色体异位/基因融合、基因突变、基因重排、甲基化、微卫星不稳定（MSI）等，为病理诊断、临床治疗提供更多有价值的信息，发现对不同治疗方式更为敏感、疗效更好的患者群体，有助于临床制定个体化治疗方案，指导伴随诊断用药、监测疗效及判断预后等。

目前，分子病理诊断技术已应用在肺癌、结直肠癌、淋巴癌、乳腺癌等临床常见肿瘤的诊疗中。其中，与双脱氧法测序（sanger）、聚合酶链式反应（PCR）等传统检测方法相比，NGS技术具有明显的通量优势，可在一次检测中对上百万甚至数十亿个DNA分子进行大规模重测序，从而绘制更为全面的疾病基因谱。此外，NGS可同时对数百种基因的突变、插入缺失、融合、拷贝数变异进行检测，尤其对于形态学诊断有争议的疑难病例，NGS技术能够最大程度上帮助患者找到有用的治疗靶点和预后标志物，实现真正意义上的“精准医疗”。相对于传统病理检测，NGS技术具有更快速度、更高通量、低成本人员依赖、省时、省样本、节约成本等优势，且能提供更丰富的信息以及更多治疗选择。

临床上，针对肿瘤基因外显子或单核苷酸多态性（SNP）位点进行NGS检测，可用于判断家系成员的患病风险。针对乳腺癌、结直肠癌等具有遗传性倾向的癌症（如图1），美国国立综合癌症网络（NCCN）给出了明确的风险评估及预防监测指导，要求符合遗传学入组标准的人群进行相关易感基因突变检测，并根据评估结果选择合适的预防或干预措施，在肿瘤防治工作中具有重要实用价值与意义。

图1：多易感基因突变致乳腺癌、结直肠癌发生风险升高

郭凌川教授表示：“基于NGS的肿瘤组织体细胞突变检测能够提供指导多种肿瘤的靶向用药信息。结合临床实际需求，我们可以为患者灵活设计特定病种的靶向测序方案，找到能够实现临床获益的分子突变。需要注意的是，肿瘤在进展过程中，由于微环境的改变或药物干预后疾病可能发生变异，需要实时监测并调整治疗方案。”

肿瘤突变负荷（TMB）是免疫治疗中应用最多的分子标志物之一。2017年《新英格兰杂志》发表的27种癌症的TMB与应用PD-1/PD-L1抑制剂治疗有效率的分析显示：各大常见肿瘤接收PD-1抑制剂治疗的有效率和TMB大小几乎呈线性关系（如图2），即TMB越高，PD-1抑制剂有效性越高。^[1]

图2. TMB在不同癌种中的分布及相应PD-1/PD-L1抑制剂治疗有效率

2018美国临床肿瘤学会（ASCO）年会上，来自瑞士洛桑大学医院的Solange Peters教授总结了晚期NSCLC免疫治疗前沿进展（如图3），提出TMB与PD-L1表达并不完全相关，需要两种生物标志物联合运用。

图3. PD-L1联合TMB检测应用价值

值得注意的是，免疫治疗可能引起负反应，甚至出现免疫治疗超进展（HPD），即PD-1/PD-L1治疗前后肿瘤增长速度（TGR）绝对增加超过每月50%，这与MDM2/MDM4 扩增/突变、EGFR突变、DNMT3A突变、11q13扩增、CDKN2A/B缺失等有关（如图4）。这些基因检测能够及时提示患者治疗是否出现HPD。此外，HPD还和年龄相关，年龄较大患者容易出现HPD。

图4. 免疫治疗相关分子标志物^[2]

先声诊断市场高级总监宋超介绍道：“完整、全面的基因检测不仅有助于临床制定治疗方案，其耐药检测分析能帮助靶向耐药患者及时更换合适的靶向药物，对于罕见突变的发现则有利于指导科研方向。最新发布的多项研究显示，某些驱动基因阳性的患者免疫治疗获益较差，对此类患者及时进行全面的基因检测，有助于他们尽早更改治疗方案，提高疗效。”

先声诊断市场高级总监宋超

样本的不同处理状态会直接影响NGS的检测结果，因此，对样本制备的质量控制不容忽视。《肿瘤个体化治疗检测技术指南（试行）》建议样本采用10%中性福尔马林固定，按病理学操作规范进行取材；活检标本固定24小时，穿刺样本固定时间控制在6~24小时为佳；样本经1周以上的长时间浸泡后部分DNA会被片段化，并不能检出突变，对诊断结果产生影响。

在组织切片方面，建议切取5张连续切片，其中1片进行HE染色，确认肿瘤细胞的含量。过低的肿瘤组织含量会直接影响肿瘤基因突变丰度，造成假阴性，因此，每张切片肿瘤组织的含量至少在70%以上。

随着介入技术的进步，穿刺小标本检测增加了组织标本的获取途径。穿刺石蜡标本进行NGS检测可以提供更直接的信息，1~2张石蜡切片（2ng DNA）即可满足测序需要。不同检测方法DNA样本起始量不同，全基因组测序（WGS）DNA起始量2~5 ug，全外显子测序（WES）和靶向测序均为1~2 ug，其中靶向测序是目前临床开展较为常见的测序方法。

“最新的NGS技术不仅能够定性，还能定量，这将大大有利于临床决策的制定，但对检测结果的准确性也提出了更高的要求。”郭凌川教授强调，“从样本到出具报告的每个环节都需要进行质控，其中包括样本DNA/RNA质控、DNA文库质控等，只有经过严谨的质控才能确保报告结果的准确性。”

参考文献：

[1] NEngl J Med. 2017 Dec 21;377(25):2500-2501.

[2] NatRev Cancer. 2019 Mar;19(3):133-150.