RNA测序越来越多的应用于不同样本类型的定量分析，如离体细胞、组织和液态活检中的microRNA、piRNA和snoRNA等。这些小RNA片段在癌症等疾病状态下会发生改变，可作为生物标志物帮助人们在早期阶段检测疾病。但由于存在多种RNA测序方案，不同实验室采用不同方案检测小RNA，会得到不同的结果。而且目前使用的小型RNA测序文库制备方法的准确性和重现性并没有得到系统的测试。

2018年7月17日，美国国立卫生研究院细胞外RNA通信联盟研究人员在Nature Biotechnology上发表了RNA测序的最新研究成果，来自该联盟9个实验室的研究人员评估了3种不同的小RNA测序商业试剂盒，以及Pacific Northwest研究所David Galas实验室开发的内部方法和该方法的不同改进方案。研究发现，用于小RNA测序的随机序列接头文库制备试剂盒，可能比固定序列接头常规文库制备试剂盒的检测偏差小。并且将固定序列与随机序列接头的文库构建方法结合，可以降低这种检测偏差。

由于分子尺寸差异较大，所以在同一样本中，用于检测mRNA的试剂盒不能用于小RNA测序。通常为了使小RNA更长，RNA分子末端添加接头，目前的小RNA文库制备方法主要分为两种类型：一种是添加已知固定序列接头，一种是添加随机序列接头。

该研究报道了9个不同实验室的联合检测结果，这些实验室都有各自独立的序列参考。试验中，各实验室分别检测了合成小RNA和人血浆衍生RNA样本，评估了3种采用固定序列接头的商业化文库制备方案，包括Illumina TruSeq，New England Biolabs NEBNext和TriLink Biotech CleanTag，以及6种实验室开发的随机序列接头方案及改进方案，包括PerkinElmer开发的Bioo Scientific NextFlex，2015年东英吉利大学研究人员开发的建库方案，Galas开发的内部方案等，其中Galas开发的方案也被称为4N方法。

试验流程设计

该研究的主要作者，密歇根大学Muneesh Tewari实验室Maria Giraldez博士表示，她的研究小组对利用RNA测序方法分析血液中的癌症生物标志物非常感兴趣。该研究项目的主要目的是从血液中分析RNA，为疾病早筛提供依据。因为与组织、细胞的样本不同，血液、尿液中RNA含量很小，研究团队对RNA测序也不甚了解，所以该团队决定先分析各种RNA测序方案，以便确定它们在血液和其他生物液体小RNA测序中应用效果。

研究团队共对377个小RNA文库进行了测序，还对由两组已知合成RNA组成的对照文库以及人血浆衍生RNA文库进行了测序。研究发现，不同测序方案对特异序列的存在识别偏差。在合成RNA文库的测序中，不同测序方案对16-25个核苷酸小RNA的回收率不同，并且观察到的偏差大于已知长RNA测序中存在的偏差。

尽管所有的检测方案都有一定的偏差，但Galas开发的4N方案偏差相对较小。因为在使用随机序列接头时，每个RNA分子都能获得相同的结合机会，能更好的反应样本内容。相比之下，固定序列接头会偏好结合某些序列，而对其他序列“不理睬”。如果某种含量很低的microRNA不被接头支持，最终构建的文库很可能就会漏掉这部分信息。例如，研究人员计算了读取序列的中位百分比，发现这些序列的读取比预期高10倍或者低10倍，使用固定序列接头的TruSeq、CleanTag和NEBNext方案的中位百分比在42％至62％之间，而4N方案则在3％至22％。

但在实际应用中，使用固定序列接头的商业试剂盒比4N方案应用更方便，属于用户友好型产品。而4N方案显得更繁琐乏味，这也是今后的研究设计需要考虑的问题。

PerkinElmer的NGS产品组合主管Arvind Kothandaraman表示，在售的随机序列接头小RNA试剂盒PerkinElmer，也针对PerkinElmer的Sciclone G3进行了自动化设计，提高了工作流程效率，并减少了变异性。他指出，该研究证明了减少文库制备过程中引入的小RNA测序偏倚的重要性。

目前Illumina和NEB的Biolabs尚未对该研究发表评论。

此外，研究人员发现对于相同的样本，只要严格按照操作程序进行，在同一实验室内部和不同实验室之间的重复试验中偏差一致。在评估各个标志物的丰度时，不同的文库制备方法产生了不同的结果，且测序方案造成的结果偏差可能大于实验室之间的差异。他们还证明，将固定序列与随机序列接头的文库构建方法结合，可以降低这种偏差。而且使用小RNA测序对样本中的微小RNA进行相对定量，在实验室和方法上是准确可重复的。

接下来，研究团队将对真实样本进行miRNA测序，将癌症与健康对照样本进行比较，寻找miRNA和血液中的其他循环小RNA。他们表示最有可能使用4N方案。

研究人员表示，无论使用哪种测序方案，都需要标准化。如果各个实验室都采用相同的实验方案，确保“每个小细节”都相同，那么结果变化不大，这样检测结果才能相互比较，也希望该研究成果能够为后续相关研究提供参考。

参考文献

1. Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling

2. Michigan Team Characterizes Biases in Small-RNA Sequencing Techniques