近十年来，转录组测序（RNA-seq）已成为生物学研究领域的重要研究工具，包括单细胞基因表达、分析差异基因以及mRNA可变剪接等。通常RNA-seq是在细胞群水平上（bulk RNA-seq）和单细胞水平上（scRNA-seq）完成。除了scRNA-seq被广泛应用外，bulk RNA-seq也被研究人员们广泛关注，因为bulk RNA-seq更为经济，且在实验设计中具有更大的灵活性。当研究的细胞群足以证明是“同质化”的，或者对于某些样本难以制备单细胞悬液时，bulk RNA-seq是生物学研究的一个优选方法。
但目前bulk RNA-seq文库仍然是通过分离和片段化mRNA以产生随机的cDNA测序文库（例如Truseq、NEBNext）。这些方法的文库费用和测序费用各占成本的一半，单个样本的成本约70~100美元。在涉及到大批量样本时，高昂的成本限制了研究的进步。
近日，德国慕尼黑大学研究团队在Genome Biology上发表题为“Prime-seq, efficient and powerful bulk RNA sequencing”的研究文章。研究团队通过结合多种scRNA-seq方法学，开发出一种高灵敏且具有成本效益的bulk RNA-seq方法——Prime-seq。经验证，Prime-seq与TruSeq的测序数据质量和检测基因数量等方面相似，但Prime-seq的文库构建成本不到3美元/样本。因此，Prime-seq是目前最为经济实惠的转录组测序方法。
文章发表在Genome Biology
图1. prime-seq概述。来源：Genome Biology
Prime-seq方法是基于scRNA-seq方法优化设计的，利用poly（A）富集，barcode和UMI标记生成3’标记的RNA-seq。据介绍，Prime-seq方法已经在17种生物中进行了验证并发表了22篇文章。（图1）在这些项目中，Prime-seq运行良好，平均每个样本可检测出>20000个基因，生成670万个reads，其中90.0%可比对到基因组，71.6%可比对到外显子和内含子。（图2A）为验证比对到内含子区的reads是来自mRNA而不是DNA，研究人员将不同比例的小鼠DNA与人RNA混样后进行建库和测序。结果显示，在75%的小鼠DNA混样中，仅3.6%的UMI比对到小鼠基因组，表明DNA对Prime-seq方法结果影响较小。（图2B）
图2.Prime-seq的应用与检验。来源：Genome Biology
研究人员在文库复杂性、准确性等方面定量比较了Prime-seq与标准bulk RNA-seq方法的性能。将来自Universal Human Reference RNA（UHRR）和External RNA Controls Consortium（ERCC）的5个转录组数据作为参照，与TruSeq RNA-seq方案进行对比。
结果显示，Prime-seq可用于量化基因表达的reads数略低（图3A），但Prime-seq检测的基因数量和TruSeq一样（图3B），并且显示出相似的基因表达水平分布（图3D），表明Prime-seq与TruSeq生成文库的复杂性相当。
测序的准确性，即测序得到的基因表达量能否反应mRNA的实际丰度。研究人员通过ERCC已知的mRNA丰度与Prime-seq、TruSeq的测序计算值进行比较，结果显示一致的相关性（图3C），证明Prime-seq与TruSeq的准确性相当。
对于大多数RNA-seq实验，科研人员最关心的问题之一是寻找差异表达基因。因此，RNA-seq方法的统计能力就尤为重要。Prime-seq使用了UMI，可以通过删除PCR重复来减小技术重复差异。在此基础上，研究人员根据重复次数（图3E）、表达水平（图3F）和倍数变化（图3G）等方面的试验，证明Prime-seq与TruSeq的统计性能几乎相同，即在给定FDR水平下，达到80%的真阳性发现率（TPR）。
图3.Prime-seq与TruSeq的比较研究。来源：Genome Biology
目前，BRB-seq、TruSeq、Smart-Seq、Decode-seq以及新开发的Prime-seq等RNA-seq方法在量化基因表达水平方面都表现相当。在固定的预算下，分析更多的样本可以帮助科研人员获得更多的生物学信息。研究人员计算了检测96个样本的RNA所需的试剂成本，结果表明，在500美元固定预算下，Prime-seq可以分析多达198个样本，即每个样本只需要2.53美元。因此，Prime-seq是目前最具有成本效益的RNA-seq方法。（图4）
图4. Prime-seq成本更低。来源：Genome Biology
综上所述，bulk RNA-seq方法Prime-seq与TruSeq一样强大且准确，更加重要的是，该方法更为灵敏且更具有成本效益。Prime-seq是通过barcode和UMI进行mRNA的识别和计算，在测序时并不对全长mRNA进行测序，因此可以在测序时使用混合文库（pooling）以实现成本控制。由于UMI的使用，Prime-seq还可以对测序的mRNA数量进行更为准确的定量计算。Prime-seq方法的开发将为RNA相关研究带来新的选择。
Janjic, A., Wange, L. E., Bagnoli, J. W., Geuder, J., Nguyen, P., Richter, D., ... & Enard, W. （2022）. Prime-seq, efficient and powerful bulk RNA sequencing. Genome Biology, 23（1）, 1-27.
https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-022-02660-8
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