疫苗接种是预防和控制传染病最经济、有效的公共卫生干预措施，对于家庭来说也是减少成员疾病发生、减少医疗费用的有效手。随着COVID-19大流行，与传统疫苗不同的mRNA疫苗越发为公众所熟知。除了在生物体内传递遗传信息外，mRNA还可以被转染到宿主体内产生抗原，激活宿主的免疫应答。
与传统疫苗相比，mRNA疫苗的优势在于易于设计、生产周期短、成本低、可诱导细胞免疫和体液免疫，且不与基因组DNA相互作用。但是mRNA疫苗也存在着显而易见的缺陷，例如，体外/内环境中，RNA的稳定性较差，容易因降解而失去效果；将mRNA转染到细胞后其所表达出的蛋白量有限，且不易控制，对mRNA疫苗的效力产生诸多影响。
文章发表在Nature Communications上
近日，斯坦福大学生物化学系研究团队在Nature Communications上发表题为“Combinatorial optimization of mRNA structure, stability, and translation for RNA-based therapeutics”的研究文章。该研究工作致力于提高mRNA的稳定性以及表达量，通过对数百种不同结构组合的mRNA进行研究筛选，确定了一种由5’和3’ UTR（非编码区）以及结构优化的CDS（编码序列）等元件组成的高稳定性、高表达的mRNA。同时，研究团队还开发出三款用于快速设计和筛选mRNA的工具：1.用于系统化确定UTR影响、密码子序列和RNA结构对mRNA稳定性和翻译效率影响的“PERSIST-seq”；2.用于评估mRNA在溶液中降解模式的“In-line-seq”；3.用于批量分析mRNA序列和溶液稳定性的回归模型“DegScore”。
研究团队认为，该研究结果可以为未来快速设计基于mRNA的医疗方法以及为目标蛋白定制高度结构化的mRNA等研究提供帮助。
1.使用“PERSIST-seq”探索稳定且高表达mRNA的设计规则
为制定稳定、高表达mRNA的设计规则，研究人员筛选了大量组合5‘ UTR、CDS和3’ UTR等区域元件的mRNA。（图1a）将获得的包含233个mRNA序列的文库转染到细胞中，并通过测序进行量化。借助计算工具“PERSIST-seq”，研究团队平行测定了不同mRNA组合变体在溶液中的稳定性、细胞内的稳定性和翻译效率。（图1b）结果显示，翻译活跃的mRNA具有更多数量的相关核糖体，翻译停滞或翻译差的mRNA相关核糖体较少或只与40S核糖体亚基相关（图1c）。对于5‘ UTR变体组，发现5’ UTR影响目标mRNA翻译效率的潜力最大（图1d）。其中，细胞和病毒起源的5‘UTR带给目标mRNA最高的核糖体载量（图1e）。随后，研究人员以SARS-CoV-2基因组RNA为例，对结构化的5’ UTR进行详细的诱变分析（图1f）。最为显著的结果是，SARS-CoV-2 5’ UTR中删除SL1提升了核糖体载量，接近hHBB核糖体载量水平。（图 1g）
图1. PERSIST-seq概述和工程性提升mRNA稳定性策略。来源：Nature Communications
2.“In-line-seq”和“DegScore”揭示了提升mRNA稳定性的另一原则
与上述mRNA设计的原则不同，mRNA结构的计算预测虽然重要，但某些序列和结构特征会导致mRNA未配对区域的水解增强或抑制。此外，不仅仅是未配对就会水解，例如碱基特性和局部结构特征也可能在mRNA降解中发挥作用。
为了降低这些潜在影响，研究人员使用In-line-seq工具，获得了3030个RNA片段的单核苷酸测量值。（图2a）通过毛细管电泳验证和其他工具的过滤，产生了2165个序列和相关的二级结构（图2b），并发现对称的茎环结构要比不对称的更为稳定（图2c），利用假尿苷ψ或m 1 ψ代替U会抑制mRNA的水解（图2f）。研究人员采用毛细管电泳测量mRNA的半衰期结果与预测一致。（图2g和2h）
为了将这些发现结果归纳成一个预测模型，研究人员基于In-line-seq数据训练了一个称为“DegScore”的回归模型（图2d），定量描述了mRNA稳定性相关的特征，如3’ U附近的水解速率较高。
图2. In-line-seq揭示溶液中mRNA降解的因素。来源：Nature Communications
3.整合最优设计规则提升mRNA的稳定性和蛋白表达量
最后，研究团队通过整合优化的UTR区和CDS区，从大量的设计中挑选了最优设计，包括对密码子进行一定程度的优化和使用ψ代替U等手段。对每个设计都进行毛细管电泳以测量半衰期，获得了“Ribotree_LinearDesign_degscoreall_1”这一优化的mRNA设计方案。（图3a和3b）为验证结果的可靠性，研究团队将其与已发表的其它研究结果以及进行了稳定性和表达量的比较。（图3c、3d和3e）结果表示，Ribotree_LinearDesign_degscoreall_1在两周内保持了较高水平的稳定性（图3d），在两周内的表达量活性只降低了2%，相较于其他4种mRNA，表达活性最稳定（图3e）。
图3. mRNA结构、稳定性和翻译效率的组合优化。来源：Nature Communications
该研究报告了一种mRNA设计方法，可以增强溶液中mRNA的稳定性，同时维持甚至增加其在细胞内的蛋白质表达。经过对比，该研究设计的“Ribotree_LinearDesign_degscoreall_1”mRNA蛋白质输出增加了约1.7倍，溶液中的半衰期增加了约2.5倍。研究团队表示通过这种设计方法，可以对任何蛋白质进行靶向的mRNA设计，以加速推动基于mRNA的治疗方案。
Leppek, K., Byeon, G. W., Kladwang, W., Wayment-Steele, H. K., Kerr, C. H., Xu, A. F., ... & Das, R. (2022). Combinatorial optimization of mRNA structure, stability, and translation for RNA-based therapeutics. Nature Communications, 13(1), 1-22.
https://www.nature.com/articles/s41467-022-28776-w
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