由于致病性STR扩增等位基因的大小和序列构象具有多样性，其涉及的疾病种类较多且患病率较高。利用现有分子技术进行分析往往出现耗时长、诊断不准确的情况，因此急需改进STR分子的表征方法。此外，许多致病性STR扩增的复杂度和高GC含量使得其难以通过短读长测序进行分析。

近日，悉尼加文医学研究所研究团队在Science Advances发表了题为“Comprehensive genetic diagnosis of tandem repeat expansion disorders with programmable targeted nanopore sequencing”的文章。研究团队通过对牛津纳米孔技术公司（ONT）具有“ReadUntil”功能的测序设备进行了编程，使其能够检测约40个已知的STR扩增疾病相关基因，解决了分子检测和短读长测序中复杂的STR扩增问题。此外，研究团队还对37位患者的DNA样本进行了靶向ONT测序，进一步证实了可编程ONT测序在STR基因诊断中的有效性和实用性。

ONT的ReadUntil功能可对所有已知的致病性STR基因座进行简单、经济、高效的测序。为了评估ReadUntil在STR分析中的应用，研究团队首先使用开源软件包Readfish对37个基因组的DNA样本进行了靶向测序（图1）。将基因组DNA剪切成15~25kb的片段，并在ONT MinION流通池上进行测序。结果显示，与目标reads（N50=12.5 kb）相比，非目标reads（N50=2.5 kb）的片段长度不断减少，表明ONT ReadUntil可以准确排除目标区域以外的片段。此外，ONT ReadUntil还实现了与全基因组ONT测序相似的覆盖深度（图1）。

图1. 用ONT-ReadUntil靶向已知致病性STR位点。来源：Science Advances  

为确定可编程靶向ONT测序的有效性和实用性，研究团队分析了25例来源于不同神经遗传疾病患者的DNA样本，包括HD、FXS、CANVAS、脊髓延髓肌萎缩症（SBMA）、强直性肌营养不良型1型（DM1）、神经元核内包涵体病（NIID）、弗里德赖希共济失调（FRDA）；肌萎缩侧索硬化症（ALS）、脊髓小脑共济失调1型（SCA1）、眼咽肌营养不良症（OPMD）。

HD是一种神经退行性疾病，由基因HTT内多聚谷氨酰胺STR扩增大量异常重复的“CAG”基序引起，因此HD的基因诊断需要准确的等位基因特异性STR测定。分析结果显示，通过ONT ReadUntil测序确定的STR等位基因长度与临床试验中检测到的长度完全一致。

脆性X染色体综合征是一种不完全外显性X连锁显性遗传病，男性患者占比较多且症状较重。脆性X染色体综合征的致病基因为FMR1，含有“CGG”三核苷酸重复序列。此外，FMR1相关疾病的致病机制也与DNA甲基化（5mC）有关（图2）。因此，除了检测STR的大小和内部序列外，FMR1相关疾病的完整基因诊断还需要DNA甲基化分析。分析表明，ONT ReadUntil测序能正确地将受影响的男性个体、女性携带者与未受影响的个体区分开来，并将突变前等位基因与完全致病性STR扩增区分开来。

图2. HTT和FMR1的单倍型解析组装和DNA甲基化分析。来源：Science Advances  

CANVAS是一种神经退行性运动障碍，多数由基因RFC1中的双等位基因“AAGGG”STR扩增引起。但RFC1中扩增的STR等位基因具有不同的基序构象，除了典型的致病基序“AAGGG_exp”外，“ACAGG_exp”基序和混合“AAAGG_10-25AAGGG_exp”构象都被认为是致病的（图3）。所以需要以等位基因特异性的方式解析STR扩增，这对CANVAS患者的基因诊断具有挑战性。

研究团队使用ReadUntil对6例CANVAS患者进行了靶向测序。结果显示，与传统测序方法相比，ONT ReadUntil测序很容易区分两个STR等位基因，识别出不同的“AAGGG₁₀₁₀”、“AAAGG₉₆₀”构象，突出了ONT ReadUntil测序分析较大、较复杂STR的实用性。

图3. STR等位基因的多样性。来源：Science Advances 

为进一步证明ONT ReadUntil测序的广泛实用性，研究团队对SBMA、DM1、NIID、FRDA、ALS、SCA1和OPMD患者进行深度分析。结果显示，在所有情况下，ONT ReadUntil测序都能够正确地对相关STR进行基因分型（图4）。上述结果表明，靶向ONT测序能够对神经致病性STR位点进行准确地单倍型分辨定量、序列测序和DNA甲基化分析，为STR扩展障碍导致疾病的基因诊断提供了新的研究方法。

除了疾病相关STR基因外，研究团队还通过ONT ReadUntil测序分析了28个药物基因组（PGx）基因。许多PGx基因都具有高度多态性，常存在结构变异，并具有紧密的同源性，因此难以使用标准分子技术或短读长测序对其进行基因分型。与短读长测序不同，ONT ReadUntil测序实现了CYP2D6及其邻近假基因CYP2D7的完全覆盖和定相（图5）。

图5. PGx基因的靶向测序。来源：Science Advances 

综上所述，该研究证明了可编程靶向纳米孔测序在STR扩增障碍基因诊断中的有效性和实用性。与现有的分子技术不同，ONT ReadUntil测序能够在单一靶向分析中对所有已知的神经源性STR位点进行无偏大小和序列的测定，实现了全基因组纳米孔测序类似的目标覆盖率，降低了样本成本、数据存储和计算要求。ONT ReadUntil测序有望成为STR基因的研究利器，并为许多尚未解决的病例提供分子诊断新方法。