目前，鉴定正常组织中体细胞突变的常用方法之一是通过NGS技术进行深度测序，如双链测序（DS）。DS技术能够在数千个非突变基因组中检测出单个突变DNA分子，识别正常组织中携带突变的细胞，并有效地将测序错误率从10^-3降低到<10^-7。

近日，华盛顿大学Rosa Ana Risques研究团队在Cancer Research 发表了题为“Colorectal cancer is associated with the presence of cancer driver mutations in normal colon”的研究文章。研究团队开发了一种名为CRISPR-DS的超灵敏单分子突变检测技术，基于CRISPR的靶向富集提高了文库制备效率，能以超高灵敏度检测健康人群和CRC患者中正常结肠的突变。此外，该研究还评估了正常结肠活检中常见的CRC相关基因突变（TP53、KRAS、PIK3CA和BRAF）作为结直肠癌风险标志物的潜在临床价值。

文章发表在Cancer Research 

CRISPR-DS能够对选定的基因组区域进行超精确的深度测序，这些区域被CRISPR-Cas9切割成预定大小的片段。在制备文库之前，选择这些片段进行目标富集，可以提高测序效率。

研究团队对3种常见的CRC细胞系（HCT116、SW480和HT29）进行了深度测序，随后使用CRISPR-DS对24名非CRC患者和23名CRC患者的正常结肠上皮进行超深测序。结果显示，CRISPR-DS能够超灵敏地检测正常结肠和CRC细胞系中的突变（图1）。

图1. CRISPR-DS能够超灵敏检测正常结肠样本中的癌症基因突变。来源：Cancer Research 

研究人员比较了CRC患者与非CRC患者正常结肠中的编码和非编码突变频率。结果显示，CRC患者正常结肠中的非编码突变频率与非CRC患者相似，但编码突变频率明显较高；非编码突变频率随年龄增长显著增加，编码突变频率与年龄无关。

为进一步探索CRC患者和非CRC患者正常结肠中编码突变的特征，研究团队通过突变谱对其进行了分类。结果表明，C>A和T>A这两种类型的突变明显较多（图2）。

图2. CRC患者的正常结肠具有更高的编码突变频率，与年龄无关。来源：Cancer Research

根据COSMIC数据库对CRC突变热点的外显子进行深度测序，该研究探索了编码突变基因（BRAF、PIK3CA和KRAS）的分布。结果显示，BRAF突变均不对应于典型热点V600E突变；只有两个PIK3CA突变对应CRC中最常见的3个PIK3CA突变；13个KRAS突变中有7个对应密码子12/13中的致癌热点突变。总的来说，30%CRC患者的正常结肠中携带KRAS热点突变，而非CRC患者不携带KRAS热点突变。

研究团队对TP53相关所有外显子进行了深度测序。结果显示，在正常结肠中发现的TP53突变中，超过四分之一（27.1%）是热点突变或高影响突变。此外，研究团队还在25%非CRC患者和52.2%CRC患者的正常结肠中发现了TP53驱动突变。上述结果表明，CRC患者结肠中存在大量KRAS和TP53驱动突变（图3）。

图3. 正常结肠携带常见CRC基因突变，这些突变在CRC患者中更丰富且致病。来源：Cancer Research 

同时，研究团队分析了CRC患者正常结肠中突变克隆的起源，对19例CRC患者中肿瘤DNA相同的4个基因区域进行测序，并对突变进行分类。结果显示，多数CRC患者的肿瘤和正常组织中至少有一种非同义TP53、KRAS或PIK3CA突变（图4）；所有患者的正常组织都携带了其肿瘤中未检测到的其他癌症基因突变。上述结果表明，CRC患者正常结肠中的大多数突变与其肿瘤中发现的突变不同，这增加了肿瘤发生的可能性。 

图4. CRC患者正常结肠的突变不同于其肿瘤突变。来源：Cancer Research 

进一步评估TP53突变，并根据突变在蛋白质DNA结合域中的位置、癌症中的频率以及致病性对其进行分类。结果显示，与非CRC患者相比，CRC患者的TP53突变频率更高，且具有致病性。正常结肠中的TP53突变在CRC患者中更常见，并且与CRC中报告的突变更相似（图5）。

图5. 正常结肠中发现的TP53突变在CRC患者中比无癌患者中更具致病性。 来源：Cancer Research 

综上所述，该研究揭示了健康人群和CRC患者的正常结肠都携带常见的CRC基因突变，但这些突变在癌症患者中更为丰富。在CRC患者的结肠中，致病性KRAS突变和TP53突变的独立克隆的发生是一种常见事件。该研究结果加深了人们对结肠体细胞进化的理解，为早期和晚期CRC的不同致癌机制提供了见解，为使用正常结肠活检进行CRC风险评估提供了可能。