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卢煜明团队最新液体活检研究:锯齿末端或为cfDNA新特征,为无创产前检测、癌症预测打开新思路

血浆无细胞DNA(cfDNA)已广泛用于无创产前检查和癌症液体活检研究。血浆中cfDNA片段的物理特征(例如片段大小和末端)引起了人们的极大兴趣,随即cfDNA片段组学领域兴起。在血浆DNA片段组学研究中,关于双链血浆cfDNA分子是否可能带有单链末端,仍未得到充分研究。

近日,香港中文大学卢煜明教授研究团队开发了基于甲基化的方法以分析cfDNA片段的“jagged ends(锯齿末端)”。结果显示,大多数(87.8%)cfDNA分子存在锯齿末端。胎儿DNA分子的锯齿末端平均长度比母体的平均长度更长,且胎儿DNA的锯齿末端整体上更紧密。在肝细胞癌患者中,与非肿瘤DNA相比,肿瘤来源的DNA分子呈现出更多的锯齿末端。此外,锯齿程度随血浆DNA片段大小而变化,且与核小体模式有关。该研究成果已在Genome Research发表,文章题为“Detection and characterization of jagged ends of double-stranded DNA in plasma”。

卢煜明教授

液体活检研究领域先驱卢煜明教授领导了该研究,其团队已开发了多种方法来分析cfDNA。此前发表的文章详细介绍了使用甲基化分析方法跟踪cfDNA,可进行癌症组织溯源和非侵入性产前诊断。此外,其团队研究还发现,特异性cfDNA末端的基因组坐标可被用作癌症生物标志物,寻找血液ctDNA的癌症信号。在这项最新研究中,研究团队分析了血浆cfDNA分子是否含有锯齿末端。

锯齿末端在此前的研究中很少被发现,因为通常在大规模平行测序的文库构建之前,DNA末端修复过程会将锯齿末端转变为平末端。此外,研究团队还开发了相应的分析方法,称为“Jag-seq”(jagged end analysis by sequencing),以分析锯齿末端的存在是否与各cfDNA分子的起源组织有关。Jag-seq方法可进行DNA末端修复,以在原始序列和锯齿状末端之间引入差异甲基化信号,具体为在DNA末端修复过程中使用的是未甲基化的还是甲基化的胞嘧啶(C)。

图:“未甲基化”Jag-seq方法检测cfDNA锯齿末端。

第一种方法被称为“未甲基化”Jag-seq方法。研究人员利用CpG位点的甲基化水平鉴定了cfDNA锯齿末端。通过使用Taq聚合酶和带有未甲基化C的dNTPs延伸DNA链的锯齿末端构建平末端。随后,利用亚硫酸氢盐处理DNA,将所有未甲基化的C转化为U,从而使甲基化C保持不变。如果cfDNA分子包含锯齿末端,则靠近末端的CpG位点甲基化水平将低于远离末端的甲基化水平。

图:“甲基化”Jag-seq方法检测cfDNA锯齿末端。

由于CpG位点在人类cfDNA中并不常见,研究团队开发了第二种甲基化Jag-seq方法,该方法用甲基化Cs填充带有5'突出末端的DNA分子。其产生的平末端经过亚硫酸氢盐处理,甲基化水平相对以前具有锯齿末端的cfDNA片段而言更高。

卢煜明教授表示:“我们可以检测锯齿末端的起始位置,并观察未甲基化的天然C,然后掺入下一个人工甲基化的C。只要看到未甲基化C及其旁边有一个甲基化C,那就是锯齿末端。从血液样本采集到亚硫酸氢盐测序进行数据分析,该流程可以在大约三天内产生结果。”

研究中,卢煜明团队从30名孕妇的队列以及另一个队列中采集血液样本,包括34名肝细胞癌患者、17名慢性乙型肝炎病毒患者和8名健康对照者。从样本中扩增并提取血浆后,研究人员对这两个队列进行了Jag-seq分析。

图:孕妇血浆cfDNA片段的锯齿末端。

图:胎儿cfDNA的锯齿末端平均长度比母体的锯齿末端平均长度更长。

在孕妇队列中,研究人员使用甲基化Jag-seq方法分析了孕妇cfDNA的锯齿末端差异。结果显示,胎儿cfDNA的锯齿末端平均长度比母体的锯齿末端平均长度更长,而胎儿DNA的锯齿末端整体上更紧密。

图:与非肿瘤cfDNA相比,肿瘤来源的cfDNA呈现出更多的锯齿末端。

图:锯齿末端与cfDNA片段大小有关。

在第二队列研究中,研究人员将未甲基化Jag-seq方法应用于肝细胞癌患者的血液样本,发现与非肿瘤cfDNA相比,肿瘤来源的cfDNA呈现出更多的锯齿末端,表明cfDNA锯齿末端具有用于检测肝细胞癌患者的诊断潜力。此外,研究发现,锯齿末端的大小取决于cfDNA片段的大小,且似乎与核小体模式有关。目前该方法的工作曲线下面积为0.87,卢煜明教授指出,该方法可能会与其他方法结合使用,以实现更高的灵敏度和特异性。

为了确定cfDNA片段锯齿末端的生物学意义,研究团队分析了锯齿末端是否可以作为小鼠中DNASE1和DNASE1L3活性的标记。研究发现,敲除DNASE1可抑制小鼠血液样本中cfDNA锯齿末端的数量,敲除DNASE1L3可增加锯齿末端的数量。与背景DNA相比,胎儿cfDNA和肿瘤cfDNA中也出现了更多的锯齿末端。因此,研究人员认为核酸酶可能在产生锯齿末端中起作用。

卢煜明教授认为,未甲基化Jag-seq方法可用于分析许多现有的亚硫酸氢盐测序数据集,但甲基化Jag-seq方法可以更精确地定位锯齿末端的基因组特定位置。“也就是说,这种锯齿末端分析可以帮助检测任何分析目标的踪迹,无论是来自胎盘还是癌症组织。”研究团队计划在将来增加癌症患者和孕妇的样本量,有助于更好地了解锯齿末端与相关疾病之间的关系,探讨不同临床情况下cfDNA片段锯齿末端的异常形态。

加州大学洛杉矶分校病理学和实验室医学系的研究员Jasmine Zhou认为,这项研究的数据表明,锯齿末端特征可能比cfDNA片段大小更能预测癌症。同时,她很期待看到该团队能否使用锯齿末端来推断体内癌症来源,以及如何将锯齿末端与其他标记(例如甲基化)更好地结合起来,以提高Jag-seq方法的诊断能力。

cfDNA锯齿末端代表了越来越多的片段组学标记物的新成员,该最新发现也凸显了理解cfDNA片段化特征的重要性。目前,卢煜明团队已申请了与该研究中开发的Jag-seq方法相关的多项全球临时专利。新开发的Jag-seq方法可以检测和表征cfDNA分子的锯齿末端,并揭示了锯齿末端可能是cfDNA断裂的一种新的物理特性,有可能为基于cfDNA片段组学的分子诊断在无创产前检测、器官移植、肿瘤学和自身免疫性疾病开辟新的思路。

参考资料:

1.Detection and characterization of jagged ends of double-stranded DNA in plasma. Genome Res. 2020. doi: 10.1101/gr.261396.120

https://genome.cshlp.org/content/early/2020/08/14/gr.261396.120.abstract

2.'Jaggedness' of Cell-Free DNA Ends Correlates With Fetal, Tumor Origin, Study Finds

https://www.genomeweb.com/liquid-biopsy/jaggedness-cell-free-dna-ends-correlates-fetal-tumor-origin-study-finds#.X02sm-N2ttg

 

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本文由 测序中国 作者:戴胜 发表,转载请注明来源!

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