作为三代测序技术的代表企业，来自英国的Oxford Nanopore Technology（以下简称Oxford Nanopore）在十几年的发展历程中可谓几番沉浮，在与Illimina终止商业化协议后，它也终于闯出了一片自己的天地。如今，Oxford Nanopore 正在研发一种液滴式纳米孔测序技术。该液滴式纳米孔测序技术利用了公司的VolTrax自动化文库制备系统元件和现有的纳米孔技术。Oxford Nanopore首席技术官Clive Brown在近日举办的用户大会上介绍了这项新技术，并分享了公司业务及产品研发进展。
Oxford Nanopore首席技术官Clive Brown
作为Oxford Nanopore的“镇店之宝”，MinlON是目前世界上唯一上市的便携式DNA测序仪，也是目前该公司测序平台中最成熟、使用最广泛的一款。其外形比U盘大不了多少，凭借在埃博拉疫情爆发展现的出色性能而名声大噪，随后又被美国宇航局（NASA）送入国际空间站，在太空完成了DNA测序。Brown表示，公司迄今为止已经出售了6000~7000台MinION。MinION测序仪的最新版流动槽（flow cell）正在研发中，名为“D Chip”。D Chip具有升级版电子芯片（ASIC），能够确保更长的运行时间，最长可达到100个小时，由此产生的数据可达30Gb。
MinlON测序仪
除了MinION的升级计划，Brown还介绍了公司桌面式测序仪GridION（通量介于现有的MinION和高通量平台PromethION之间）的近况。目前，已经有来自24个国家的100多个用户购买了GridION测序仪，其中已有13家用户被公司认证为服务提供商，而且更多的用户正在申请和认证中。目前，基于GridION测序平台的服务提供商主要分布在美国、中国、加拿大、日本、法国、英国和荷兰，包括多家测序公司和研究机构。
对于Oxford Nanopore公司的高通量测序平台PromethION，目前已经完全投入商业化运营，迄今为止已经出售40套，另外20套也将在六月底前交付。Brown表示，目前出售的PromethION测序仪均为beta版，一次最多可以运行24个流动槽。Brown表示：“用户可以购买以进行升级。”下一个版本将允许用户并行运行48个流动槽。Brown在会上承认，虽然PromethION的延期推出对公司而言的确“有点小尴尬”，但公司正在全力以赴，保证用户在使用这款测序仪时可以获得更高的数据产量。
PromethION升级计划
今年早些时候，一批早期购买PromethION的用户曾谈起使用该仪器的初体验：每个流动槽的产量约50~100Gb。Brown表示，现在很多用户的数据产量已经超过了50Gb，相当多用户可以达到60~70Gb，一小部分用户甚至可以达到每个流动槽超过100Gb。在公司内部测试时，一个PromethION流动槽的产量可超过160Gb。如今，Oxford Nanopore有了更大的目标，公司正计划将每个流动槽的数据产量提升至250Gb，并进一步提升至500Gb。
在公司的近期规划方面，Oxford Nanopore公司正在研发一种适用于PromethION的单通道流动槽，它将更容易加载和运行，并计划在六月份发布这款产品。这款流动槽将拥有更高的有效小孔率，且不易产生气泡。此外，当前的多通道流动槽会根据早期用户的反馈意见进行重新设计，并将在今年晚些时候重新发售。同时，公司将在六月份实现所有适用于MinION 测序仪的试剂，同样适用于PromethION测序仪，尤其是RNA直接测序试剂。
从长期发展来看，Oxford Nanopore正在研究一种新型的自动化液滴式测序技术，该技术将能够实现微量DNA的测序，包括单细胞测序。这项技术将结合VolTrax样本制备平台的元件和MinION测序仪技术，最终开发出一款目前还未命名的新仪器，这也将成为Oxford Nanopore下阶段的主要产品。但Brown并未透露该设备商业化的时间。
据介绍，不同于将纳米孔插入芯片小孔顶部的隔膜中，这项新技术将通过两个微流控液滴接触面的纳米孔进行电流测定。为了达到这个目标，两个液滴（其中一个液滴溶液中包含纳米孔）在VolTrax设备中被拉得极为接近，并紧靠着引导电极。当液滴接触时，将在它们表面形成一个双层膜，然后施加电压，引起一个小孔插入液滴共有的膜区域中，DNA通过这个小孔从一个液滴移动到另一个液滴中，然后通过测定小孔中的电流进行测序，测序的过程将类似于MInION。
这套设备可以使测序时间更长，DNA也会在测序后进行进一步处理，例如PCR扩增。总的来说，这将使大量非常复杂的工作流程成为可能。但不可否认的是，这款新设备的通量可能偏低——Oxford Nanopore的目标是拥有128个通道。Brown认为，虽然这是一个颇具野心的目标，但是这款设备将能够允许单细胞的插入、溶解以及测序，这还是有很大吸引力的。
目前，公司已经搭建了一个具有DNA提取区、一个文库制备区和一个测序区电路试验板芯片，并展示了一些概念验证实验的数据。在这个实验中，单个HeLa细胞被移动到芯片中，并使用电压进行溶解。Brown表示：“如果你只有极少量的材料，那么这套设备可以帮助你进行测序。”
Brown还提出了现有测序技术的一系列升级，包括软件和样本制备仪器的升级，其中一项升级是来自于一名用户。此前，来自诺丁汉大学的Matt Loose研究小组发现，Oxford Nanopore公司的MinKonw软件错误地将长reads拆分成了短reads。在上月初发表于BioRxiv网站的文章中，作者描述了他们如何纠正这个错误：该方法让他们发现一段长度为2.3Mb的连续片段，这段序列之前被软件错误地识别为11个连续的reads。
Brown推测，只要测序时提供的DNA不是碎片化的，而且没有卡在小孔中，将来会产生更多更长的reads，甚至可能达到整条染色体的长度。为了解决DNA卡在小孔中的问题，Oxford Nanopore公司在最新升级的MinKonw软件v2版中加入了一个名为“逐步激活”（progressive unblock）的新功能。Brown解释道，之前的方法是利用反转电势来激活小孔，但这种方法往往会破坏通道；而新方法的处理方式则更温和，进而保证了更高的数据产量。
此外，Oxford Nanopore公司研发了很长一段时间的流动槽适配器“Flongle”将在本季度提供给早期用户，预计将在第三季度完全实现商业化。
该设备包含了MinION和GridION流动槽中昂贵的电子元件，但Flongle的流动槽会相对便宜一些，但是是一次性使用的。不同于目前MinION流动槽中含有512个通道，Flongle的流动槽包含128个通道。一个Flongle流动槽运行16小时预计可产出1Gb数据，通过优化后可达到3Gb。这个通量对于基因panel和细菌、病毒基因组测序将有很大价值。每个流动槽的价格将在100美元左右，并将打包出售。
相较于即将闪亮登场的Flongle，另一款产品就在“冷板凳”坐了很久了。早在2016年，Brown就透露正在开发一种可以连接智能手机的纳米孔设备，名为“SmidgION”，并预计在2017年末投入使用。从目前的情况看来，显然这款产品已经被打入了“冷宫”，这也于当日得到了Brown的证实。他表示，SmidgION是一款配备更小流动槽的手机测序仪，其商业化推出计划将被搁置，因为样本制备技术还不够便捷和精巧。但他透露，一旦不再需要大型设备进行样本制备时，这款测序仪就会被推出。
手机测序仪SmidgION
对于SmidgION，虽然搁置归搁置，但是Oxford Nanopore可一直没停下研发的脚步。为了实现这一目标，Oxford Nanopore公司一直在研究一种单管DNA提取设备“Zumbador”，目前已经更名为“Ubik”。该设备技术流程相较简单：将唾液或拭子样本放入管中后，细胞溶解；DNA吸附到固相载体上并在重力作用下沉淀到管底，然后落入测序流动槽中；DNA在流动槽中得到进一步处理并用于测序。Brown表示，Ubik制备过程耗时约10分钟，但是需要更多的研究工作来获得更好的产出。有趣的是，在Brown的演讲过程中，公司还对此进行了现场演示，一名公司研究人员使用Ubik提取了来自Brown唾液样本中的DNA，并在MinION仪器上进行测序。
除了以上两款产品，还有几项产品的最新动态同样值得关注。在将VolTrax文库制备仪v1版本（Brown称之为“原型机”）提供给早期用户后，Oxford Nanopore一直在致力于研发该文库制备仪的v2版。如今，v2版将在今年8月份发货，该版本可以同时处理10个样本，具有15个入口，可以进行PCR，并提升了磁力控制，能够提供用于DNA和RNA质控的荧光检测。整套设备定价为8000美元，其中包含文库制备仪、多种配套试剂和MinION 流动槽。另一款名为“MinION Mk1C”的设备可将MinION或Flongle设备器与MinIT计算模块（MinIT是Oxford Nanopore开发用于替代MinION必须配置的笔记本电脑）整合到一起，MinION Mk1C预计将在今年年底推出。
自动化文库制备系统VolTrax
对于靶向测序，Oxford Nanopore正在开发一种方法：使用失活的Cas9酶和向导RNA获得目标区域，然后将其转运到小孔附近。Brown表示，公司计划将在今年晚些时候将该方法开发成一种试剂产品并投放市场。RNA直接测序一直都非常受欢迎，公司不久将推出新版试剂，将每秒读取70个碱基提升到每秒读取110个碱基。同时公司也在寻找新的马达蛋白来进一步提高读取速度。
测序准确率也是实际应用中的一个硬标准。Brown表示，Oxford Nanopore一直在努力提升其测序技术的准确率。其中一种方法是采用更好的软件，并在更大范围的DNA序列中对软件进行训练。正如此前所述，均聚物仍然是错误的最大来源。为了提升测序技术的准确率，另一种方法是使用两种或两种以上类型的纳米孔，每种纳米孔都具有不同且不相关的的错误模式。公司已经测试了两种纳米孔来探索这个概念，包括R8（或lysenin）和R10，它们正作为极具潜力的产品得到大力研发。Brown还表示，即使是现有R9.4小孔的突变型，也能够正确检测出一些最初版本无法检测到的均聚物。最后，除了以上两种方法，还能通过将DNA样本转化为合成分子来提升准确率，例如将T转化为U，然后对两种分子进行测序。
从软件角度方面，公司计划于今年下半年在MinKonw软件中启动“read until”的软件功能，让用户能够实时进行碱基识别，并在获取到足量数据时停止实验。此外，Oxford Nanopore创立的Metrichor公司近年来一直在开发一个名为“EIP2ME”的生物信息平台，为那些没有生物信息支撑的研究人员提供分析流程。该平台既可以在云端运行，也可以在本地运行，Oxford Nanopore计划于第三季度在MinIT上发布该平台。
参考资料：
1. Oxford Nanopore Outlines Droplet-Based Sequencing Technology, Planned Updates
2. Clive G Brown: CTO plenary from London Calling
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