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舀一瓢水,知一池鱼|解读基于NGS技术的新应用领域“环境DNA(eDNA)”检测

来源:Illumina

舀一瓢水,知一池鱼——eDNA揭示海洋生态系统多样性

广阔的夜空有几颗星,浩淼的海域有几条鱼,是科学界一直努力解答的问题。

来自澳大利亚珀斯科廷大学的分子生物学家Micheal Bunce教授一直致力于解决第二个问题。

澳大利亚珊瑚湾以海洋生态多样、尤以珊瑚品种丰富闻名。2017年,Micheal Bunce教授和他的同事来到海边,和众多观光者不同,此次出行,他们的船周挂着装满海水的样本瓶。Bunce教授满怀期待的站在船边,每航行一段距离,他就小心翼翼拉起承载无数遗传信息的收集瓶。他清晰的知道,这小小的瓶子里,承载的很可能是传统方法无法解密的生态系统密码。回到实验室后,他们对含有遗传信息 “面包屑”的海水进行了深入分析。

成果很是惊人,仅仅利用收集的9公升海水,短短几个月,他们便绘制了珊瑚湾的整个生态系统图谱,并对生物一一进行了详细的分类。这些图谱包括这片海域的动物、植物、真菌、假菌和原生动物信息,是目前此片海域生态系统最全面貌的展示。Bunce教授此次采用的是高通量测序(NGS)研究环境DNA(environmental DNA, eDNA)技术。显然,这是目前传统调查方法完全无法比拟的。就最常见的拖网方法而言,且不论操作的笨重,在同一海域也就仅能捕获到20余种不同的鱼类。而通过对eDNA的分析,仅仅通过采集海水,除了可以检测到常见于餐桌的金枪鱼、石斑鱼类,以及水下视觉测量可见的沙丁鱼外,目前尚无其他技术可以充分取样的隐底栖鱼类,以及热衷于夜间活动的鱼类在eDNA技术下也一览无余。

Bunce教授对此次获得的成果却并不惊讶。自2003年,和同事从史前西伯利亚永久冻土核心和新西兰洞穴沉积物中成功提取出DNA并测序以来,他就坚信环境DNA可以提供给我们更多跨越时间和空间的物种信息,可以带领我们快速高效地了解一个生态系统的全貌。

检所未见——eDNA助力特定物种的发现

eDNA技术在水生生态系统的意义不可低估。在水生环境中,由于部分生物行为难以捉摸、呈低密度分布,传统方法捕获的概率极低,而eDNA技术可以提供关于物种存在和分布的更多线索。

来源:Illumina

海马是海洋中最难以捉摸的鱼类之一,它们行动缓慢,性甚懒惰,却能有效捕捉到行动迅速、善于躲藏的生物。他们伪装得太好,很难用不具有破坏性的方法去研究。这一次,Bunce教授团队分别奔赴南非和澳大利亚海域,希望通过收集海水追踪海马行踪。他们小心翼翼的将采集到的海水带回实验室,浓缩其中的有机组分并提取出DNA,构建文库,测序读取序列后,与数据库中的海马DNA序列进行比对。他们惊喜的发现,这“一瓢水“,轻松捕获到了海马的痕迹。 跨越时间和空间,eDNA同样在施展独特魅力。

领航鲸在波罗的海地区踪迹一直难以寻觅。2012 年,奥尔胡斯大学的Philip Francis Thomsen教授团队,通过eDNA技术,惊喜的从波罗的海发现了长肢领航鲸的行踪。

斑鳖被称为最孤独的生物之一。2018年4月,美国华盛顿州立大学Caren Goldberg教授通过eDNA技术为三只斑鳖找到伙伴,确认了全球第四只斑鳖就在越南。

透视历史——eDNA的前世今生

eDNA技术如此受关注,它到底是什么呢?

DNA作为遗传信息存在于生物的每个细胞中。当我们环境中生长活动时,个体独特的DNA会如同“面包屑“般随时掉落到四周,它的存在形式可能是血液、组织、粘液、细胞、鳞片,也可能是粪便、尿液,甚至可能是生物本身。这些释放到环境中的DNA,便是我们所说的环境DNA(eDNA)。

不同生物的DNA是独特的,都存在特定的保守序列,可以通过试验和生信分析对这些保守序列进行分析。目前,分析eDNA最常用的方法是包括定量聚合酶链式反应技术(qPCR)和基于高通量测序的宏条形码技术(metabarcoding)。它们可以高效快速获取物种信息。这些信息不止可以告诉研究者目标生态系统的生物多样性,也可以帮助我们研究难以发现的生物体。另外,在生态系统受到威胁时,也可以利用eDNA检测来分析哪些物种受到了影响。

来源:Illumina

eDNA技术如此神奇,它到底是什么来头呢?

eDNA的概念由来已久。早在1987年,就有研究者在讨论沉降物DNA提取技术中,首次提出环境DNA的概念。1990年,eDNA技术首次在海洋微生物DNA研究中崭露头角。2003年,eDNA第一次成功应用于大型生物的研究。直到2010年前后,逐渐有研究者将“环境DNA”技术引入到水生生物监测中,以期调查海洋中的生物多样性。之后,伴随着高通量测序技术的助推,eDNA研究成本越来越低,效率越来越高。eDNA技术在生态领域研究的应用也得到了越来越多的关注。

在困境中发展——eDNA成为主流技术的门槛

尽管eDNA测序的应用日益广泛,但它距离成为主流技术还有一定的门槛。

eDNA最大的困难,在于DNA的获取像一场数字游戏。往往存在概率或者“运气”的成分,做到天时地利人和还需要更多的探索。

eDNA的存在受时间、空间因素影响非常大,如季节、水温、水流潮汐等均可以影响海洋生态系统eDNA的存在及含量,且eDNA的存在时间非常短。班戈大学的Simon Creer教授的研究发现,eDNA持久性只有2天,且在酸性环境会加速降解。

不同底物保存的eDNA信息可能会有差异。例如有些鱼常在浅水域活动,有些则喜欢在泥沼中穿梭。Bunce教授的研究发现,由于不同物种的生活习性不同,不同底物的获取可能使研究者低估生态系统的多样性。

来源:Illumina

eDNA技术尚未完全成熟。Bunce教授直言:“eDNA方法可能看起来很简单,但事实上,要用好却很难“。
eDNA极易受到污染,要求实验室环境必须绝对洁净,以维持所得数据的保真度。这在绝大部分实验室是很难做到的。

低丰度物种在生态系统中起着重要的生态功能并极具研究价值,但它们脱落的DNA信息却非常少。如何在复杂的eDNA中高效获得痕量DNA仍是挑战。Bunce教授提倡用硝酸纤维素膜过滤联合DNeasy增强提取效率。然而,这并不是完全通用的方法,优化样本富集及提取方法仍需更多探索。

eDNA的丰度与生物体数量的相关性还有待挖掘。由于生物体释放DNA的速率不同,环境中的生物体数量和脱落的DNA不具有直接关联,只能通过物种存在与否来测量相对丰度。目前,也有大量的研究者致力于从eDNA数据集中推导出更多关于“量”的信息。

另外,DNA数据库的全面性是关键因素。若DNA数据库没有全面、高质量的储备,即使突破了重重困难获取了eDNA信息,这些信息也只能是零散的字母,无法准确匹配和命名。这也是目前相关研究人员正全力完善的工作。

即使困难重重,eDNA在生态系统多样性调研中的重要性仍无法忽视。“由于eDNA技术具有无创、成本低、敏感性强的特点,我们建议尽早将此方法整合到生物多样性监测的标准程序中。“Micheal Bunce教授如是说。

参考资料:

1. Gert-Jan Jeunen .et al,Environmental DNA (eDNA) metabarcoding reveals strong discrimination among diverse marine habitats connected by water movement,Mol Ecol Resour,2019 ,doi: 10.1111/1755-0998.12982.

2. Gert-Jan Jeunen .et al,Species-level biodiversity assessment using marine environmental DNA metabarcoding requires protocol optimization and standardization ,Ecology and Evolution ,2019,doi: 10.1002/ece3.4843 .

3. Clare I.M. Adams. et al,Beyond Biodiversity: Can Environmental DNA (eDNA) Cut It as a Population Genetics Tool? ,Genes, 2019, doi:10.3390/genes10030192 .

4. Joseph D. DiBattista .et al,Digging for DNA at depth: rapid universal metabarcoding surveys (RUMS) as a tool to detect coral reef biodiversity across a depth gradient,Peer J ,2019, doi: 10.7717/peerj.6379 .

5. Michael Stat.et al,Ecosystem biomonitoring with eDNA: metabarcoding across the tree of life in a tropical marine environment, Sci Rep ,2017,doi:10.1038/s41598-017-12501-5 1 .

6. Ida Bærholm Schnell .et al,Debugging diversity - a pan-continental exploration of the potential of terrestrial blood-feeding leeches as a vertebrate monitoring tool , Mol Ecol Resour,2018,doi: 10.1111/1755-0998.12912 .

7. 越南发现斑鳖:eDNA技术确认全球第四只斑鳖的存在,https://news.china.com/discovery/13001650/20180417/32315878_all.html#page_2
8. eDNA测序为了解生物多样性变化提供了强大的工具,https://www.illumina.com.cn/science/customer-stories/icommunity-customer-interviews-case-studies/bunce-curtin-interview-edna-nextseq-miseq-iseq.html

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本文由 测序中国 作者:陈初夏 发表,转载请注明来源!

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