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清华大学郭永团队合作开发新型微液滴数字PCR系统,解决临床应用三大痛点

微滴数字PCR是一种单分子水平的核酸检测和定量分析技术,因其具备高灵敏度、高准确性,无需校准曲线即可实现绝对定量等特点,被认为是继荧光定量PCR和NGS之后,基因检测领域又一个令人振奋的创新技术。在微滴数字PCR测序过程中,微滴技术可将PCR反应体系分割为大量的微液滴,并且绝大多数微液滴仅含有0个或1个模板分子(分别称为“阴性微液滴”和“阳性微液滴”)进行检测。分析系统可根据获得的荧光信号强度对检测数据进行分类,并最终获得模板分子的绝对拷贝数。

在检测过程中,“阳性微液滴”与“阴性微液滴”之间的荧光信号对比度偏低,PCR反应后的开放式操作引入污染等原因,都容易导致检测错误,因此微液滴数字PCR对荧光检测技术的灵敏度和如何有效防污染有很高的要求。此外,PCR数据分类也是一个关键步骤,决定了微液滴数字PCR定量结果的准确性。目前微液滴数字PCR的数据分类方法主要有两种:一种是针对每种反应定制的监督分类算法,这种算法准确性较高,但需要针对不同样本类型和检测指标开发不同的分类算法;另一种是通用的非监督分类算法,但其准确性和可靠性较低。

为解决上述三个问题,清华大学医学院生物医学工程系郭永实验室与新羿生物等合作者展开了系列相关研究。2019年8月,该研究团队在TalantaAnalyst先后发表了微滴数字PCR的两项最新研究成果。研究团队通过创新技术的整合,实现了微液滴数字PCR的高精准和防污染检测,并建立了一种PCR数据非监督分类的新方法。有效解决了微滴数字PCR在临床应用中的三个痛点:高灵敏度、防污染和自动化分析,为微液滴数字PCR的临床应用提供了一种新研究思路,有望在临床检测中获得广泛应用。

高灵敏度、防污染的微液滴数字PCR

8月1日,郭永实验室及合作者在Talanta在线发表文章《A "Quasi" Confocal Droplet Reader Based On Laser-Induced Fluorescence (LIF) Cytometry for Highly-Sensitive and Contamination-Free Detection》。该研究创新地采用了“准共聚焦”式检测光路和全封闭的微流控芯片,实现了微液滴数字PCR的高精准和防污染检测。

研究人员采用了“准共聚焦”式荧光流式来构建微液滴阅读仪的光路。该激发光路采用新型的离焦激发模式,可以最大限度地激发整个微液滴内的荧光信号,提高“阳性微液滴”与“阴性微液滴”之间的信号对比度。此外,该荧光检测光路还提高了荧光信号的信噪比。借助该光路,研究人员实现了10-10,000模板拷贝的微液滴数字PCR高灵敏度检测,相对误差小于5%,线性度r²>0.998。

图:“准共聚焦”式检测光路和全封闭的微流控芯片。

同时,研究人员还设计了新型微流控芯片。该芯片采用了一种“密封-穿刺”的结构,可以保证检测过程的严格密闭,避免微液滴核酸扩增产物的污染。为验证该芯片的性能,研究人员对表皮生长因子受体基因(EGFRT790M突变位点进行了连续7天的检测。将6管未加任何模板的EGFR T790M反应体系暴露于微液滴阅读仪周边15分钟,充分地接触、吸收可能从微液滴阅读仪中逸出的气溶胶污染。检测结果显示,未加模板的EGFR T790M反应体系全部呈阴性,证明该微液滴阅读仪能够有效避免微液滴数字PCR的污染。

数字PCR数据分类新方法

8月5日,郭永研究团队及合作者在Analyst以封底(back cover)形式在线发表文章《A density-watershed algorithm (DWA) method for robust, accurate and automatic classification of dual-fluorescence and four-cluster droplet digital PCR data》。该研究将微液滴数字PCR的数据密度分布与分水岭算法(一种图像分割方法)有机结合,建立了一种微液滴数字PCR数据非监督分类的新方法。

图:密度分水岭算法实现微液滴数字PCR数据自动分类的原理及Analyst杂志封底。

研究人员模拟人眼对微液滴数字PCR数据的分类过程,将微液滴数字PCR数据作为一幅图像,提出了一种新型的数据分类方法——密度分水岭算法。该方法通过数据密度分布的判断,使用分水岭算法自动、非监督的将网格化(图像化)的微液滴数字PCR数据沿着数据相对稀疏的位置分割为若干区域,最后通过这些区域的边界实现准确、可靠、自动的非监督数据分类。

为比较密度分水岭算法与现有主流商业化算法,研究人员进行了EGFR的L858R和T790M突变位点的检测。分析结果显示,密度分水岭算法的检测限是现有主流商业化算法的1/40,显著提高了微液滴数字PCR的自动化检测分析能力。随后,研究团队利用Bio-Rad QX200和新羿TD-1两种微液滴数字PCR系统,在254例冰冻组织、石蜡包埋组织和外周血临床样本中验证了密度分水岭算法。检测结果显示,密度分水岭算法在超过84%临床样本中的定量结果优于现有主流商业化算法,且全部临床样本未出现假阴性和假阳性结果。

    结    语

以上两项研究成果为微液滴数字PCR的临床应用提供了一种高灵敏度、防污染的自动化检测分析系统,也为其临床应用提供了新的研究思路。随着精准医疗的发展,开发高灵敏和防污染的单分子核酸检验和定量分析技术对于疾病的筛查、诊断、用药指导、病情监测和预后均具有重要意义。微滴数字PCR的检测成本比NGS更低,更加实用,在肿瘤液体活检、无创产前筛查、感染性疾病早期诊断等临床检测应用中具有显著优势,在拷贝数变异、突变检测、基因表达和二代测序建库等生命科学研究中也有广泛应用。相信随着技术的发展,微液滴数字PCR仪将在疾病诊断和治疗中发挥越来越重要的作用。

参考资料:

1.A “quasi” confocal droplet reader based on laser-induced fluorescence (LIF) cytometry for highly-sensitive and contamination-free detection.

https://doi.org/10.1016/j.talanta.2019.120200

2. A density-watershed algorithm (DWA) method for robust, accurate and automatic classification of dual-fluorescence and four-cluster droplet digital PCR data.

https://doi.org/10.1039/C9AN00637K

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本文由 测序中国 作者:陈初夏 发表,转载请注明来源!

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