2017年对于基因测序来说注定是不平凡的一年。今年3月，张鹍教授团队在Nature Genetics（NG）杂志发布了令人振奋的研究成果，利用更灵敏的算法配合组织甲基化模式开发的无创诊断技术，可以检测并定位肿瘤。无创，意味着更加安全和便捷；灵敏度更高，意味着可以更早发现癌症。半年后，同样基于甲基化标志物，张康教授和徐瑞华教授团队在Nature Materials（NM）杂志上报道了一项更大规模的肝癌诊断和预后研究，与NG文章的结论相互印证，该研究成果就像是破译了肿瘤的特异指纹，使得肝癌无处遁形；这也意味着甲基化标志物应用于癌症诊断或是筛查更进了一步。
那么，肿瘤指纹到底是什么？甲基化指纹有何优势？研究人员到底使用了什么样的技术来破译肿瘤甲基化密码？我们首先对两篇文章的总体思路和技术手段做个比较，再来做技术的剖析（为方便描述，两篇文章分别命名为NG和NM）。
图1：甲基化标志物研究技术比较以及WGBS和450K结果的相关性分析 （图1B节选自[1]）
首先，通过比较肿瘤和正常细胞的DNA甲基化数据找到肿瘤特异的甲基化Marker， 如图1A所示，NG和NM文章分别选择了WGBS（二代测序）和450K（芯片）得到的基础数据，WGBS和450K都是非常出色的甲基化检测技术，结果的相关性也很高（图2B）。筛选出甲基化Marker后，NG和NM分别采用RRBS和Padlock技术进行后续验证，这两种技术都是基于NGS平台的高通量甲基化测序方法，分别基于酶学和探针杂交原理；可能是由于候选位点较多，NG文章选择了检测范围更大的RRBS技术，Padlock受限于探针设计，比较适合稍小区域的靶向测序（NM文章对1000个靶标中的401个成功设计了探针）。比较完总体思路后，我们再来介绍一下肿瘤ctDNA指纹。
图2： ctDNA的三种指纹
游离DNA（cfDNA）是组织细胞在凋亡解体后释放到血液中的DNA被核酸酶切割而产生的长度在170bp左右的DNA片段。在血液中由肿瘤细胞所释放的DNA片段，被称为ctDNA（Circulating Tumor DNA），所以，癌症患者的cfDNA中含有ctDNA。请注意，ctDNA的含量非常非常低，远远达不到很多文章中提到的20ng/mL血浆（某些癌症，或是中晚期癌症患者有可能达到）。NM的研究结果表明：肝癌患者血浆中ctDNA的含量为平均5 ng/mL左右[2]。
为了追踪肿瘤，我们需要找到ctDNA与正常cfDNA之间的不同，即破解肿瘤特异的“指纹”信息。在ctDNA层面，目前的研究表明，我们可以通过甲基化修饰状态、序列突变、核小体占位等事件，来描绘肿瘤的指纹信息（如图2所示）。而检测不同的事件，需要依赖不同的检测手段，如序列突变需要基于DNA的重测序，甲基化检测一般需要做基于亚硫酸氢盐（BS）的BS-seq。那么，其中甲基化指纹有什么优势呢？
幸运的是，甲基化位点的数量远远超过点突变，且基因组上距离较近的CpG位点会同时被甲基化或是去甲基化，这就意味着可以将一簇CpG位点作为整体进行分析（CpG簇在下文称为Methylation Block或MB），通过横向模式和众向丰度得到信号更强的甲基化小单元，NG文章的研究表明， MHB大小为95bp并含有三个以上的CpG位点[3]，这个长度更容易存在于~170bp的cfDNA并被检测到（如图3所示），再借助多个MB形成的肿瘤特异的甲基化单倍体模式进行联合判定，进一步提升甲基化指纹的准确性，即通过多点联判得到更加精确的ctDNA甲基化指纹。
图4：多个甲基化指纹增强信号（修改自[2]）
接下来，我们对张康教授和徐瑞华教授团队在Nature Materials文章中用到的Padlock技术作简要地介绍。Padlock探针于1994年首次报道，其构象与挂锁类似，所以命名为Padlock。2009年Padlock技术首次应用于高通量甲基化靶向测序，属于高效的亚硫酸氢盐转化后建库方法，被称为“BSPP”（点击链接，查看此前报道）；2012年，Nature Methods发布了BSPP探针的设计软件“ppDesigner”；商业化服务方面，安捷伦和罗氏公司分别在2012和2016推出了Padlock类捕获技术。
图5：Padlock技术发展及应用于甲基化检测
优劣势
Padlock技术介于PCR和杂交捕获之间，因此也同时继承了二者优缺点。一方面，Padlock技术比杂交捕获更简单，比PCR更特异，另一方面，与PCR技术相比，Padlock技术更为繁琐，且相比与杂交捕获技术，其均一性稍差。
为了获得更加全面的甲基化图谱，WGBS技术可能是更优选择，更为高效的WGBS技术也有待开发；由于肿瘤组织占比和异质性的缘故，目前得到的肿瘤指纹是一个平均值，如何获得更高分辨率的甲基化模式仍需探索；此外，在获得更高特异性的甲基化修饰模式后，快捷、高效的ctDNA甲基化检测技术有待开发。
基础研究是医学转化的基石，目前我们对于肿瘤的了解还是太少，甲基化标志物初现端倪，但路还很长，希望与业界同仁一起努力，实现cfDNA的更多应用。
参考文献：
1. Distinct DNA methylomes of newbornsand centenarians.
2. Circulating tumour DNA methylationmarkers fordiagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma.
3. Identification of methylation haplotype blocks aids in deconvolution ofheterogeneous tissue samples andtumor tissue-of-origin mapping from plasma DNA.
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