图1. 整体实验设计概述及数据处理流程

针对评估空间转录组学方法面临的挑战，研究人员精心设计了系列基准研究来应对。首先，研究选择了一组理想的参考组织样本，这些参考组织样本遵循以下标准：该组织来自广泛使用的模式生物，并且大多数研究机构都能获取；该组织具有稳定的细胞类型和特异性标记基因表达；参考区域还应具有清晰的形态，并且在切片中易于被发现。连同参考组织，研究团队还开发了一种切片方案，能够帮助研究者在未来重现并生成可比较的数据。除此之外，研究团队还使用了多个基准指标和工作流程，使得在相同的组织区域比较不同的方法成为可能。最终，研究团队在genographix.com 上生成了cadasSTre，这是一个用于sST基准测试的跨平台数据集。研究团队在35个实验中对11种sST方法进行了系统评估。

图2. cadasSTre平台首页

整体来看，该研究全面比较了各方法从基本指标到下游分析的各个方面的数据，包括灵敏度、聚类性和标记基因检测等，并总结了每个评估步骤中使用的方法。分析结果表明，空间转录组学需要更多的测序数据才能达到饱和，而研究中所使用的数据远低于饱和水平。Stereo-seq、Slide-tag、Visium（基于探针）在原始测序深度下显示出更好的捕获效率， Slide-seq V2、Visium（基于探针）、DynaSpatial 在标准化测序深度下具有更好的捕获效率。

图3. 不同平台生成数据的敏感性比较

虽然spot大小已成为评估每种方法分辨率的一个重要指标。但该研究发现扩散（Diffusion）是影响实际分辨率的关键因素。此外，透化优化实验表明，改变透化时间对扩散有很大影响。具体而言，在针对每种组织类型优化透化时间时，不同的技术在不同组织类型中表现出不同的扩散特征。虽然某些技术能识别亚细胞spot大小，但由于灵敏度有限和扩散较高，其实际分辨率无法达到与具有真正单细胞分辨率的Slide-tag相同的水平。因此，未来sST的进一步发展将受益于增强的扩散控制和改良的透化条件和时间。

图4.不同平台产生的数据扩散比较

分析结果还表明，为空间数据设计的聚类工具可能并不比单细胞的聚类方法表现更好。换言之，虽然在某些数据集中纳入额外的空间和组织学信息会提高聚类的准确性，但与仅使用基因表达数据相比，这并不能始终如一地改善聚类结果。研究还发现，来自单细胞维度的细胞注释可能无法产生详细的细胞状态，来自空间数据的聚类则可以给出互补的结果，并且其在解析具有空间模式的稀有细胞状态方面表现更好。因此，在注释空间转录组学数据时，考虑有和没有单细胞转录组数据作为参考对于后续的分析很重要。