2023年5月12日，M20 Genomics团队在知名期刊Nature Communications上以《High-throughput single nucleus total RNA sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded tissues by snRandom-seq》为题发表了一种新的基于随机引物的高通量单细胞核测序技术snRandom-seq，并成功将其用于对FFPE样本的检测。
作为M20 Seq技术在FFPE样本领域的重大应用突破，snRandom-seq是一种适用于FFPE样本，且具有高灵敏度和全长特点的高通量snRNA-seq技术。该新方法的面世为实验室和临床FFPE标本提供了一个强大的单细胞平台，将极大推动FFPE样本或其他低质量的生物样本单细胞核转录组检测，有望应用于更大范围的生物学研究和临床实践中。
福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）是临床检验、随访主要的样本保存方式，构成了数量庞大且具有巨大价值的临床资料库。
在过去几年中，高通量单细胞（核）转录组测序（scRNA/snRNA-seq）方法已经彻底改变了整个生物医学研究领域。准确鉴定临床FFPE样本中每个细胞的转录组学特征，可以更好地理解细胞的异质性和种群动态，进一步提高人类疾病的精确诊断、治疗和预后。但由于FFPE制作过程中，RNA交联、修饰和降解，FFPE组织单细胞（核）分离及RNA捕获仍然具有挑战性。
目前主流的高通量单细胞（核）转录组平台主要依赖oligo(dT)捕获RNA分子poly(A)尾，不能捕获降解的RNA，因此局限于检测成熟mRNA、新鲜或新鲜冷冻的样本。研究人员一直尝试开发各种不同的方法来克服这些挑战。
近期，在bioRxiv上发布了两种方法——snPATHO-Seq和snFFPE-seq，提供了从FFPE组织中分离细胞核进行snRNA-Seq的优化方法。snPATHO-Seq是基于探针的10X Genomics技术，基于已知物种和已知序列设计探针，因此只能检测到有限的基因；而snFFPE-seq尝试利用常规的基于poly(A)的技术路线进行捕获，由于FFPE样本中RNA发生降解，无法通过捕获poly（A）的方式获取有效RNA，因此该方法的灵敏度较低。
随着生物医学发展，对临床标本进行大规模和全面的转录组分析来识别新的预测性生物标志物或罕见的细胞类型的需求越来越迫切。因此，需要一种能够在FFPE组织上进行高通量、高灵敏度和高覆盖率的snRNA-seq检测方法。
snRandom-seq主要工作流程如图1所示。首先，获取的FFPE组织进行脱蜡复水、细胞核分离、以及透化。为了避免基因组污染，使用阻断引物与裸露的单链DNA结合，通过多次退火和延伸进行原位阻断。然后，随机引物和oligo（dT）引物进入细胞核与RNA结合，对全转录组的RNA分子进行原位逆转录。通过末端转移酶（TdT）将Poly（dA）原位添加到cDNA的3’末端。之后，基于VITACruiser单细胞平台进行高通量单细胞核标记。最后，进行破乳纯化、cDNA扩增、二代文库构建以及测序分析。
图1.使用 snRandom-seq技术进行FFPE样本检测流程
snRandom-seq具有非常高的细胞标记特异性，检测2000多个细胞的双胞率仅为0.3%（图2a）。同样，UMI具有非常高的物种特异性（99%）（图2b），这表明snRandom-seq产生了高质量的单核文库。此外，还检测到许多长链非编码RNA（lncRNA）和短链非编码RNA（sncRNA），包括核仁小RNA（snoRNA）、核小RNA（snRNA）和microRNA（miRNA）（图2c），表明snRandom-seq可以进行全转录组捕获。293T细胞核中的单核基因中位值是4141，UMI中位值是11596，平均测序深度是~29k reads/cell；3T3细胞核的单核基因中位值是3427，UMI中位置是9795，平均测序深度是~25k reads/cell（图2d,e）。
图2. 使用人-鼠混合细胞系对snRandom-seq进行性能测试
从同一小鼠组织中收集FFPE和新鲜样本，并使用snRandom-seq比较它们的转录谱（图3d）。FFPE和新鲜样本的全转录组谱具有良好的相关性（图3e）。使用snRandom-seq对同一FFPE样本进行2次独立检测（图3d），两批基因表达谱具有高相关性（图3f）。以上结果表明，snRandom-seq能从FFPE、新鲜组织中获取相似的、足量信息，且具有可重复性。
将snRandom-seq的FFPE结果与其他报道的FFPE snRNA-seq结果进行比较。从snRandom-seq数据中成功鉴定出FFPE组织中的数千个细胞核（图3h），并发现了广泛的RNA类型（图3g），其中lncRNA大约是snFFPE-Seq方法检出数的8倍，而且snoRNA、scaRNAs和miRNA仅在snRandom-seq中检测到。snRandom-seq检测到的基因中位数均超过3000，且数据未饱和，显著高于其他两种高通量snRNA-seq方法（图3h）。
Genebody分布图显示，基于oligo(dT)引物的snFFPE-Seq显示出明显的3’端偏好；使用snPATHO-seq的探针技术（10X Flex）显示出5’端偏好；而snRandom-seq数据5’-3’覆盖均一（图3j），表明随机引物与RNA是均匀结合，额外的oligo(dT)引物对FFPE样本的RNA捕获不佳。对于单细胞核水平上的覆盖率，snRandom-seq的覆盖率远高于snFFPE-seq或snRATHO-seq（10X Flex）（图3k）。对于单基因水平上的RNA覆盖，C1S、EMG1、KLRG1三个基因的序列分布图表明了探针技术与随机引物策略存在关键差异（图3l，附图8d）。10X Flex获取的序列仅限于探针靶区（< 100 bp）；而snRandom-seq检测到的序列均匀分布在外显子区和内含子区。
以上结果表明，snRandom-seq可以捕获FFPE组织中更多的RNA，且基因覆盖度更高。
图3. snRandon-seq与其他两种FFPE snRNA-seq方法的比较
snRandom-seq在FFPE中检测到外显子的同时，还可以检测到内含子序列（图3b），因此可以用于区分新转录的RNA（未剪接）和成熟的RNA（未剪接），更适合于RNA速率分析。睾丸中的精子是研究细胞动力学极好的模型，利用snRandom-seq进行小鼠睾丸FFPE样本的分析，t-SNE显示了生殖细胞处于连续过渡阶段（主要是早期精母细胞和晚期精母细胞），未分化的精原细胞和成熟的精子细胞分别聚成细胞簇（图4a）。根据新生转录本计算的速率，展示了各类型细胞中的不同速率矢量方向，特别是在位于早期和晚期精母细胞左侧的细胞中（图4a，b）。
结合基于基因表达的细胞周期状态分析，RNA速率分析显示G2M期的两个晚期精母细胞亚群上有明显的细胞成熟轨迹，这两个亚群具有活跃的转录活性（图4c）。
图4. snRandom-seq显示FFPE小鼠睾丸组织的RNA速率分析及细胞周期状态分析
1.snRandom-seq在MTM肝癌亚型FFPE标本中发现了一个增殖亚群
将snRandom-seq应用于一个保存2年左右的MTM肝癌亚型临床FFPE样本（图5a），获得5914个有效细胞核，单核中位基因数为3220、UMIs为8182个（图5c），注释出人类肝脏的主要细胞类型（图5d）。并且从样本中检测到广泛的RNA类型，包括lncRNAs、snRNAs、miscRNAs、miRNAs和snoRNAs（图5f）。其中，一个特定的肝细胞亚群（hepatocyte-2）高表达增殖标记物MKI67和其他两个标记物（ASPM和TOP2A）（图5e），大部分细胞处于G2M期；hepatocyte-2与浆细胞之间的通讯有特定的配体-受体对，主要通过BMP信号通路接收来自浆细胞的信号（图5g-i），据报道这与肝癌肿瘤进展相关。综上，snRandom-seq从临床FFPE标本中发现了一个特定的增殖和激活的肝细胞亚群。
图5. snRandom-seq在MTM肝癌FFPE人类标本标本中发现了一个增殖亚群
2.snRandom-seq在肝癌FFPE标本中检测到不同的lncRNA
对FFPE肝癌标本进行snRandom-seq检测，获得了较高的基因数和UMI数，并鉴定出肝脏的主要细胞簇（图6b，c）。lncRNA在以往单细胞转录组研究中总是被忽略。snRandom-seq数据中肝细胞簇显著表达lncRNA，且不同肝细胞簇表达的lncRNA存在差异，提示可能存在不同的发病机制（图6d）。snRandom-seq具有全长转录本覆盖的优势，在癌症生物学的lncRNA分析中显示出了前景。
图6. snRandoy-seq在人肝癌FFPE标本亚群中检测到不同的lncRNA
对结直肠癌肝转移（CRLM）患者的一对初始和复发的FFPE临床标本进行了snRandom-seq检测。在两个样本中鉴定了主要细胞类型（图7b、c）。复发样本的T细胞的比例更高（图7d），表明复发样本中有更活跃的抗肿瘤免疫反应。复发样本的主要肿瘤簇（cancer cells-1、2和3）的比例持续下降；然而cancer cells-4的比例增加（图7d）。进一步分析发现，编码脂质组成调节因子（SCD）和蛋白结合脂质（APOA2，APOC3和APOA1）的基因，在复发样本的cancer cells-4中表现出高表达水平（图7e），表明复发CRLM的癌细胞簇中脂质代谢可能增强。
图7. snRandom-seq显示了初始和复发的FFPE标本的细胞异质性
M20 Genomics开发的该项新技术，可通过随机引物高灵敏度地捕获FFPE样本的全转录本的全长信息，将极大推动FFPE样本或其他降解生物样本单细胞核转录组检测。
与传统单细胞技术相比，snRandom-seq具有更低的双胞率，以及更高的基因检出数，且数据5’-3’覆盖度均一，在单细胞水平、单基因水平的覆盖度高于其他两种FFPE snRNA-seq方法。本文中，利用snRandom-seq方法，作者探究了小鼠以及人类临床肿瘤FFPE样本的细胞异质性，并可进行精细分群以及生物功能预测。由于snRandom-seq可捕获全转录本的全长信息，更适合进行RNA速率分析、非编码RNA分析等。
M20 Genomics已于2022年八月向市场推出基于M20 Seq技术的VITA系列高通量单细胞全长转录组平台，并在同年12月份与国内多家知名单细胞科技服务商签订战略合作协议，携手打造基于M20 Seq技术的新一代单细胞技术（Next Generation Single Cell technology，简称“NGSC”）生态合作体系，以推动VITA平台在科研、临床和制药等领域的商业化应用。NGSC首批生态合作伙伴暨授权服务商包括（按拼音排序）：安诺优达、贝纳基因、伯豪生物、格物致和、基迪奥生物、联川生物、美吉生物、欧易生物、瑞普基因和序科码生物。如果您对该产品感兴趣，请联系我们的NGSC服务商咨询。
M20 Genomics（简称“M20”）成立于2021年2月，是一家专注于单细胞产品及相关技术开发的生命科技公司，总部位于中国杭州。
M20主创成员来自国内外顶尖高校，长期从事单细胞测序及相关技术的研究和应用，在各自领域内拥有全球领先的科研和转化成果。公司自主研发的全球首个基于随机引物的全样本高通量单细胞测序产品 – VITA系列，突破性地实现了全样本类型、全物种和全长RNA的（超）高通量单细胞转录组测序。
M20立志打破壁垒，找到前行的力量，探索生命的本源，以新一代单细胞技术引领生命科技的发展。
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