结直肠癌（CRC）的不同患者之间存在显著的生物学和临床差异，因此根据生物学特征指导CRC患者的个体化治疗仍具有挑战。2015年，临床医生和科学家根据肿瘤基因表达（转录组学）对CRC进行分类，分为Consensus Molecular Subtype（CMS1-4）4大类，是迄今为止最强大和最广泛使用的转录组学分类系统。。

但CMS分类依赖于整个肿瘤的转录组分析，无法区分癌细胞和其他基质细胞（例如免疫细胞、成纤维细胞和血管细胞）。此外，多种细胞类型混淆了特异性基因表达的比例。近年来，随着技术的发展，科研人员发现单细胞转录组测序（scRNA-seq）可以基于细胞分辨率表征转录组，从而识别细胞类型及其表达谱。

研究团队分析了63名CRC患者的373,058个单细胞转录组，特别是49,155个上皮细胞，基于不同的基因表达、DNA拷贝数和基因调控网络，确定了CRC恶性细胞普遍存在的遗传和转录组二分法，进而对该疾病分类系统进行了改进。该研究成果对CRC相关药物开发以及更加精准的治疗方案设计具有重要意义。

图：总研究框架。来源：Nature Genetics

随后，研究团队通过主成分分析划分出两个不同的上皮亚群，并由此定义了两种主要且界限清晰的CRC肿瘤亚型：iCMS2和iCMS3（以下简称i2、i3），揭示了一种不同于以往CRC分类的中心二分法（图1）。接下来，研究团队使用SCENIC确定了347个转录因子调控的单细胞活性评分，并使用这些评分对61例CRC患者的上皮细胞进行聚类分析，同样重现了上述两种上皮亚型，表明这两种上皮亚型是CRC中普遍存在的基因调控程序。

该研究中，i2和i3两个子类型细化了CMS分类系统。进一步分析揭示，i3包括微卫星高度不稳定肿瘤（iCMS3_MSI）和微卫星稳定肿瘤（iCMS3_MSS），与其他MSS肿瘤相比，iCMS3_MSS肿瘤在转录学上与微卫星高度不稳定（MSI-H）肿瘤更相似；i2则与微卫星稳定肿瘤（MSS）更相似。

图1. 在scRNA-seq中发现iCMS亚型。来源：Nature Genetics

研究团队以TCGA数据库中的659例肿瘤为样本，研究了iCMS3_MSI、iCMS3_MSS和iCMS2_MSS的拷贝数变异（图2）。结果显示，i2肿瘤由特定染色体的拷贝数变异驱动；与i3相比，i2肿瘤拷贝数变异较多，TP53突变在iCMS2_MSS肿瘤中更为普遍，这可能是其整体基因组不稳定的原因。另外，iCMS3_MSI肿瘤的肿瘤突变负荷（TMB）较高，较高的TMB会导致更多的突变基因；在MSS组中，i3肿瘤富集KRAS和PIK3CA突变，i2肿瘤则富集APC和TP53突变。

图2. iCMS与基因组特征的关系分析。来源：Nature Genetics

为比较不同肿瘤类型的细胞类型丰度，研究团队根据特征性高表达基因确定了9个主要细胞群体，包括成纤维细胞、免疫细胞和内皮细胞（图3）。与先前报道一致，研究团队观察到T/NK细胞评分在MSI-H肿瘤较高；成纤维细胞、内皮细胞和单核细胞/经典树突状细胞（McDC）评分在纤维化肿瘤（CMS4）中较高。在纤维化背景下，i3肿瘤与成纤维细胞、髓样细胞和内皮细胞特征的增加和肿瘤纯度的降低相关。上述结果显示，当纤维化发生时，i3肿瘤比i2肿瘤有更大的纤维化反应。 

图3. 上皮细胞与微环境细胞的相互作用。来源：Nature Genetics

CMS分类系统基于常规转录组学，但未明确潜在的具体细胞表型。该研究鉴定了CRC的上皮细胞亚群主导的肿瘤亚型：iCMS2和iCMS3，两者在拷贝数变异、转录谱和基因调控层面均有明确的差异。此外，纤维化的CMS4肿瘤可分为iCMS2、iCMS3两个亚组，具有不同的微环境组成和生存可能性。

基于上述研究发现，研究团队根据上皮状态（I）、微卫星状态（M）和纤维化（F）对CMS分类进行改进，并提出了一个更精确的“IMF”分类。IMF包括五个亚型，分别是iCMS2_MSS_NF，iCMS2_MSS_F，iCMS3_MSS_NF，iCMS3_MSS_F和iCMS3_MSI。IMF分类为CRC的起源、演变以及对治疗的反应提供了新的见解。

文章通讯作者Shyam Prabhakar教授表示：“此前的CRC分类系统并没有充分突出分子基础。我们的团队分析了恶性上皮细胞亚型并定义了它们的特性，以使用单细胞分析了解它们与其他细胞的相互作用，以便能够准确地描述CRC的异质性。”

该研究团队计划在未来对CRC进行更加深入的分析，以表征 iCMS2和iCMS3的生物学特性、相互作用和药物反应，并重新分析来自临床试验的数据，确定这两种癌症类型之间治疗反应的差异。