CRISPR-Cas9基因编辑技术为生物学和医疗健康领域带来了革命性的变化。Cas9内切酶可在gRNA的引导下对基因组位点进行精确切割，但CRISPR-Cas9并不完美，例如导致插入非目标DNA序列，完全删除片段，错误地突变非靶标基因。
近日，加州大学圣地亚哥分校的研究团队在对果蝇白色基因座突变等位基因的体细胞同源染色体模板修复（HTR）时，意外发现Cas9 nickase变体D10A和H840A，产生了针对性的单链断裂（SSB），而不是DSB，并可进行同源染色体模板修复（HTR）。最终，研究人员基于果蝇开发了新的基因组编辑系统CRISPR-Nickase，可利用同源染色体的完整序列对DSB和SSB进行有效的体细胞修复。与CRISPR-Cas9相比，CRISPR-Nickase只改变给定基因的一个等位基因，产生的脱靶效应更少，提高了基因编辑效率。该研究发表在Science Advances上，文章题为“Cas9/Nickase-induced allelic conversion by homologous chromosome-templated repair in Drosophila somatic cells”。
研究团队认为，Nickase介导的HTR代表了一种“有效且意想不到的等位基因校正机制，在基因编辑领域具有深远的潜在应用”。
在许多情况下，遗传病患者的两个基因拷贝携带不同的突变。因此，一条染色体上的突变将在另一条染色体上有一个功能序列。研究人员利用Nickase可以切割一条DNA链而不是两条DNA链这一特点开发了CRISPR-Nickase基因编辑系统。
图：使用对应染色体的序列进行恢复性基因编辑：标准CRISPR酶Cas9提供了进行修复的能力，但也可能导致目标位点和基因组其他地方的意外突变（左）。相比之下，Nickase诱导更有效的基因纠正，没有诱变事件（右）。来源：Guichard/Bier
研究人员利用果蝇眼睛颜色突变体来可视化CRISPR-Nickase介导的HTR。这种突变体的特征是果蝇的眼睛全白，当同一只果蝇眼睛上会出现大片红色斑块，表明细胞的DNA修复机制已经成功地利用另一条染色体的功能DNA逆转了突变。研究人员将CRISPR-Nickase用于切割父系的DNA 突变并将其替换为母体中该位点的功能性拷贝。结果显示，修复后的父系基因拷贝使果蝇眼睛颜色高水平恢复，几乎与野生型苍蝇相当，表明基因编辑成功。
图：Cas9、Nickase（D10A-和h840a）诱导的修复比较。来源：Science Advances
分析发现，Nickase的表现远远超过了Cas9。在CRISPR-Cas9编辑的苍蝇中，平均每只苍蝇有20-30%的眼睛变红，但CRISPR-Nickase有50-70%的成功率，表明Nickase诱导的SSB对HTR介导的等位基因转换更有效。此外，与CRISPR-Cas9相比，CRISPR-Nickase除了高效之外，还具有更低的突变风险。Cas9导致编辑位点意外突变的几率为66%，Nickase的突变率只有0.7%。
Nickase诱导的HTR策略依赖于少量遗传成分的引入，并利用细胞机制和内源性模板将遗传改变恢复到野生型功能状态。文章共同通讯作者、加州大学Annabel Guichard博士表示：“健康的变异体可以被细胞的修复机制用于切割突变DNA后纠正缺陷突变。值得注意的是，这可以通过一个简单无害的剪切更有效地实现。”
该研究的一个关键特征是，与传统的基于Cas9的CRISPR编辑相比，基于Nickase的基因编辑系统导致的靶上和脱靶突变更少。同时，研究人员指出，在几天内缓慢、连续地输送Nickase组分可能比一次性输送更有益。
“该方法的另一个显著优点是简单性，它依赖于非常少的成分，DNA缺口是弹性的，不像Cas9会产生完整的DNA断裂，进而产生突变。”文章共同通讯作者、加州大学Ethan Bier博士表示。
“我无法相信Nickase的效果如此之好，这完全出乎意料，”加州大学圣迭戈分校比尔实验室的Sitara Roy博士表示。研究人员指出，新基因编辑系统的多功能性可以作为修复哺乳动物基因突变的模型。“我们还不知道这一过程将如何转化为人类细胞，以及我们是否可以将其应用于任何基因。为了获得人类染色体携带的致病突变的有效HTR，可能还需要进行一些调整。”
参考资料：
1.Cas9/Nickase-induced allelic conversion by homologous chromosome-templated repair in Drosophila somatic cells.SCIENCE ADVANCES, 1 Jul 2022. DOI: 10.1126/sciadv.abo0721 2022.
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abo0721
2.New ‘Soft’ CRISPR Nicking System Simple, Efficient, and Safe
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3.New CRISPR Technique Causes Few Unintended Mutations in Fruit Flies
https://www.the-scientist.com/news-opinion/new-crispr-technique-causes-few-unintended-mutations-in-fruit-flies-70186
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