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应用简报:TapeStation用于FFPE样本质量控制和MGISEQ-2000测序平台应用方案

FFPE样本是最常见的临床样本类型之一,肿瘤FFPE样本为临床与转化医学研究提供了宝贵的研究素材。在利用高通量测序技术分析FFPE来源的DNA样本的过程中,需要对初始DNA、片段化后的样本,以及测序文库构建的主要质量节点进行样本的质量控制,以确保测序结果的成功率与可靠性。此次实验利用4150 TapeStation自动化电泳系统为针对MGISEQ-2000RS测序平台的4例FFPE DNA样本进行文库构建全流程的质量控制,通过各环节的质控结果,优化建库方案,从而获得了优质的测序结果。

图1. 此次FFPE样本NGS实验的流程及所涉及仪器平台与试剂。

前言

福尔马林固定石蜡包埋是保存临床样本的最常用方法,它可以有效的保持组织的完整性,用于组织病理学研究与形态学观察。然而由于甲醛交联、核酸降解等问题,从FFPE样本中提取的DNA的质量往往参差不齐,为包括高通量测序在内的下游应用带来挑战[1]。因此,对FFPE样本来源的核酸进行质量评估对于高通量测序等高灵敏度、高成本的应用显得尤为重要。4150 TapeStation可以通过专有的DIN值(DNA完整值参数)客观地衡量FFPE DNA样本的降解程度,并自动化计算片段大小分布与浓度[2]。根据4150 TapeStation 提供的样本降解程度的信息,以及建库中间产物的浓度与片段大小信息,可以适时调整和优化建库方案,确保终文库的质量符合上机测序的要求。

实验部分

材料

肿瘤石蜡切片(甲状腺癌、宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、FFPE标准品),标准品为菁良基因提供的FFPE DNA(PN: GWC0301)。DNA提取采用华大智造的MGISP-NE32全自动核酸提取纯化仪,DNA提取试剂盒采用华大智造的MGIEasy FFPE基因组DNA提取试剂盒(NE32预装版)。DNA样品超声片段化采用Covaris 公司ME220超声波破碎仪。文库构建采用MGIEasy通用DNA文库制备试剂套装。NGS靶向捕获探针与杂交试剂采用安捷伦SureSelect Human All Exon V8 Kit和SureSelect XT HS2 DNA Kit。DNA质控分析平台采用安捷伦公司4150 TapeStation系统,试剂采用TapeStation配套的基因组DNA ScreenTape预制胶条、D1000 ScreenTape预制胶条与配套试剂,以及HS D1000 ScreenTape预制胶条与配套试剂。测序平台采用MGISEQ-2000RS系统以及FCS PE100测序试剂套装。

样品前处理
所有样本均采用MGISP-NE32纯化仪搭配MGIEasy FFPE基因组DNA提取试剂盒(NE32预装版),根据标准实验方案[3],提取核酸;用安捷伦SureSelect Human All Exon V8 靶向序列捕获试剂盒[4],结合MGIEasy通用DNA文库制备试剂套装进行标准文库构建[5]
FFPE DNA样本测序文库构建过程的质量控制
初始基因组DNA样本采用基因组DNA ScreenTape与试剂,根据实验方案[6],在安捷伦公司4150 TapeStation系统上分析其完整性与浓度;Pre-PCR预文库质控以及Post-PCR终文库的质控分别采用D1000 ScreenTape与HS D1000 ScreenTape以及相应配套试剂,根据标准实验方案[7,8],分析浓度、产量,以及目标片段大小。

结果与讨论

FFPE样本来源的基因组DNA质量

FFPE提取过程中的脱蜡和裂解步骤极为关键,脱蜡不完全会导致核酸产量低,而脱蜡时间过长又会损伤DNA的完整性。MGISP-NE32自动化FFPE基因组DNA提取方案可以提取出满足NGS测序需求的gDNA 。此次实验中,FFPE样本采用标准流程进行DNA提取,通过TapeStation基因组DNA ScreenTape胶条与试剂分析片段的完整性(DIN值),主峰大小与浓度。部分FFPE样本由于长期室温保存,样本降解较为严重。
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图2. MGIEasy FFPE基因组DNA提取试剂盒工作流程。

表1. 通过MGIEasy FFPE基因组DNA提取试剂盒提取的DNA,由4150 TapeStation分析所得的质量参数信息。 

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图3. 使用4150 TapeStation系统与基因组DNA ScreenTape胶条和试剂分析FFPE样本纯化所得的基因组DNA。

(左为胶图形式显示,右为峰图形式显示。A1为分子量Marker,H1为FFPE DNA标准品。 )

捕获前扩增的预文库质量

结合4150 TapeStation提供的DNA完整值(DIN)设置超声打断条件,所有样本的基因组DNA都在Covaris系统上进行超声波打断。将超声片段化后的样本各取400ng采用MGIEasy通用DNA文库制备套装按照标准流程进行文库构建,并根据4150 TapeStation给出的DIN值,确定PCR循环数为12个循环,以确保最佳的文库产量及复杂度。经PCR 12个循环后获得预文库。Pre-PCR 扩增后的预文库采用D1000 ScreenTape胶条与试剂分析预文库片段大小分布与浓度。

表2. 超声打断后用于构建预文库的DNA用量、捕获前预文库的扩增循环数、预文库浓度,产量与片段大小。 

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图4. 使用4150 TapeStation系统与D1000 ScreenTape胶条与试剂分析预文库的质量,文库主峰在300bp左右,片段主要集中在200-500bp之间。

捕获后扩增的终文库质量

此次实验杂交捕获方案采用捕获前混样方案。由于FFPE-4号样本预文库总量仅为130ng,因此在对4个FFPE样本预文库混合时,1-4号样本按照300ng:300ng: 300ng:100ng的比例进行4杂1的混合建库,以总量1,000ng进行杂交捕获;标准品同样取1,000ng单独进行捕获;之后均经PCR扩增12个循环生成终文库。杂交捕获采用SureSelect Human All Exon V8人全外显子探针组合和SureSelect XT HS2 Kit。使用4150 TapeStation系统及HS D1000 ScreenTape胶条与试剂对终文库进行文库质量分析。

表3. 用于杂效捕获的预文库的用量、捕获后扩增循环数、终文库浓度,以及终文库产量。

图5. 使用TapeStation 4150系统与HS D1000 ScreenTape与试剂分析终文库的质量。B1为标准品,C1为 FFPE样本4杂1。

测序结果质量

终文库在MGISEQ-2000RS系统上用FCS PE100测序试剂套装完成测序。各样本数据均一化到7.5Gb后进行分析。各项数据指标均达到预期,测序产量超过MGISEQ-2000的550M reads的标准线,过滤前后Q30均大于90%。这说明样本提取的质量,靶向捕获测序文库构建的均一性与文库的复杂度等均在比较优化的状态。

图6. 4个FFPE样本与标准品的测序质量参数。

结论

在基于MGI测序平台的测序样本前处理工作流程中,4150 TapeStation平台提供的DNA完整值(DIN)可对来源于包括FFPE样本在内的基因组DNA进行完整性评估、样本浓度测定以及片段分布分析,结果可用于指导样本投入量、调整PCR扩增循环数。在文库构建环节,4150 TapeStation平台可对预文库与终文库的产量与片段分布进行评估,确保文库的大小达到预期,并可根据预文库的产量优化多样本混合捕获实验。最终4个FFPE样本与标准品的测序结果质量指标均较为理想,表明通过MGIEasy FFPE基因组DNA提取试剂盒提取所得的FFPE DNA可以很好满足NGS测序所需求的gDNA质量,安捷伦SureSelect Human All Exon V8探针与杂交捕获试剂配合MGIEasy通用DNA文库制备试剂套装可得到的优质的WES测序文库。终文库在MGISEQ-2000RS系统上使用FCS PE100测序试剂套装,可以获得理想的测序结果。

参考文献:

1.Tang, W., David, F. B., Wilson, M. M., Barwick, B. G., Leyland-Jones, B. R., and Bouzyk, M. M., “DNA Extraction from Formalin-Fixed, Paraffin‑EmbeddedTissue”, Cold Spring Harbor Protocols, doi:10.1101/pdb.prot5138, 2009.

2.High Throughput Genomic DNA Assessment by the Agilent 4200 TapeStation System, 安捷伦科技技术概述, 出版号5991-6629EN, 2016.

3.MGIEasy FFPE 基因组 DNA 提取试剂盒( NE32 预装版)(版本号V1.0)Doc. #H-940-000071-00-00.

4.先进、成熟的技术造就高性能外显子组,产品说明,出版号5994-3154ZHCN,2021.

5.MGIEasy 通用DNA文库制备试剂套装使用说明书(版本号A4)Doc. #: B02-034.

6.Genomic DNA ScreenTape Assay for TapeStation Systems,快速操作手册,出版号SD-UF0000092 Rev. B.

7.D1000 ScreenTape Assay for TapeStation Systems,快速操作手册,出版号SD-UF0000094 Rev. C.

8.High Sensitivity D1000 ScreenTape Assay for TapeStation Systems,快速操作手册,出版号SD-UF0000091 Rev. C.

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