图1. 此次FFPE样本NGS实验的流程及所涉及仪器平台与试剂。

肿瘤石蜡切片（甲状腺癌、宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、FFPE标准品），标准品为菁良基因提供的FFPE DNA（PN: GWC0301）。DNA提取采用华大智造的MGISP-NE32全自动核酸提取纯化仪，DNA提取试剂盒采用华大智造的MGIEasy FFPE基因组DNA提取试剂盒（NE32预装版）。DNA样品超声片段化采用Covaris 公司ME220超声波破碎仪。文库构建采用MGIEasy通用DNA文库制备试剂套装。NGS靶向捕获探针与杂交试剂采用安捷伦SureSelect Human All Exon V8 Kit和SureSelect XT HS2 DNA Kit。DNA质控分析平台采用安捷伦公司4150 TapeStation系统，试剂采用TapeStation配套的基因组DNA ScreenTape预制胶条、D1000 ScreenTape预制胶条与配套试剂，以及HS D1000 ScreenTape预制胶条与配套试剂。测序平台采用MGISEQ-2000RS系统以及FCS PE100测序试剂套装。

图2. MGIEasy FFPE基因组DNA提取试剂盒工作流程。

表1. 通过MGIEasy FFPE基因组DNA提取试剂盒提取的DNA，由4150 TapeStation分析所得的质量参数信息。 

图3. 使用4150 TapeStation系统与基因组DNA ScreenTape胶条和试剂分析FFPE样本纯化所得的基因组DNA。

（左为胶图形式显示，右为峰图形式显示。A1为分子量Marker，H1为FFPE DNA标准品。 ）

结合4150 TapeStation提供的DNA完整值（DIN）设置超声打断条件，所有样本的基因组DNA都在Covaris系统上进行超声波打断。将超声片段化后的样本各取400ng采用MGIEasy通用DNA文库制备套装按照标准流程进行文库构建，并根据4150 TapeStation给出的DIN值，确定PCR循环数为12个循环，以确保最佳的文库产量及复杂度。经PCR 12个循环后获得预文库。Pre-PCR 扩增后的预文库采用D1000 ScreenTape胶条与试剂分析预文库片段大小分布与浓度。

表2. 超声打断后用于构建预文库的DNA用量、捕获前预文库的扩增循环数、预文库浓度，产量与片段大小。 

图4. 使用4150 TapeStation系统与D1000 ScreenTape胶条与试剂分析预文库的质量，文库主峰在300bp左右，片段主要集中在200-500bp之间。

表3. 用于杂效捕获的预文库的用量、捕获后扩增循环数、终文库浓度，以及终文库产量。

图5. 使用TapeStation 4150系统与HS D1000 ScreenTape与试剂分析终文库的质量。B1为标准品，C1为 FFPE样本4杂1。

图6. 4个FFPE样本与标准品的测序质量参数。

在基于MGI测序平台的测序样本前处理工作流程中，4150 TapeStation平台提供的DNA完整值（DIN）可对来源于包括FFPE样本在内的基因组DNA进行完整性评估、样本浓度测定以及片段分布分析，结果可用于指导样本投入量、调整PCR扩增循环数。在文库构建环节，4150 TapeStation平台可对预文库与终文库的产量与片段分布进行评估，确保文库的大小达到预期，并可根据预文库的产量优化多样本混合捕获实验。最终4个FFPE样本与标准品的测序结果质量指标均较为理想，表明通过MGIEasy FFPE基因组DNA提取试剂盒提取所得的FFPE DNA可以很好满足NGS测序所需求的gDNA质量，安捷伦SureSelect Human All Exon V8探针与杂交捕获试剂配合MGIEasy通用DNA文库制备试剂套装可得到的优质的WES测序文库。终文库在MGISEQ-2000RS系统上使用FCS PE100测序试剂套装，可以获得理想的测序结果。

参考文献：

1.Tang, W., David, F. B., Wilson, M. M., Barwick, B. G., Leyland-Jones, B. R., and Bouzyk, M. M., “DNA Extraction from Formalin-Fixed, Paraffin‑EmbeddedTissue”, Cold Spring Harbor Protocols, doi:10.1101/pdb.prot5138, 2009.

2.High Throughput Genomic DNA Assessment by the Agilent 4200 TapeStation System, 安捷伦科技技术概述, 出版号5991-6629EN, 2016.

3.MGIEasy FFPE 基因组 DNA 提取试剂盒（ NE32 预装版）（版本号V1.0）Doc. #H-940-000071-00-00.

4.先进、成熟的技术造就高性能外显子组，产品说明，出版号5994-3154ZHCN，2021.

5.MGIEasy 通用DNA文库制备试剂套装使用说明书（版本号A4）Doc. #: B02-034.

6.Genomic DNA ScreenTape Assay for TapeStation Systems，快速操作手册，出版号SD-UF0000092 Rev. B.

7.D1000 ScreenTape Assay for TapeStation Systems，快速操作手册，出版号SD-UF0000094 Rev. C.

8.High Sensitivity D1000 ScreenTape Assay for TapeStation Systems，快速操作手册，出版号SD-UF0000091 Rev. C.