1. ATAC-seq可以得到实验时点全基因组染色质开放信息,RNA-seq可以得到同一时点的基因表达信息,将两个组学数据联合分析,可以获得该时点下影响基因表达的的上游调控区域,寻找到影响基因表达的潜在TF(Transcription Factor)。
2. 通过对比不同细胞或者相同细胞在不同阶段的组学数据,可以对比出基因表达调控的差异。
3. 通过CUT&Tag对TF进行验证,找到与TF结合的靶基因。
ATAC-seq技术
染色质可及性(Chromatin Accessibility):在真核生物细胞中,DNA与组蛋白结合形成核小体,核小体再进一步折叠压缩形成染色质。DNA复制或转录时,染色质紧密结构被打开,称为开放染色质(Open Chromatin);未开放区域为封闭染色质(Closed Chromatin)。同时,开放区允许反式作用因子与启动子、增强子、绝缘子、沉默子等顺式调控元件相结合。这种允许调控因子结合的特性称为染色质的可接近性。
图1. 染色质开放区4种研究方法的比较(Epigenetics & chromatin, 2014, 7(1): 33.)。
在ATAC-seq技术诞生之前,FAIRE、MNase、DNasse等研究染色质开放区的方法都有明显的不足,包括涉及多个实验流程,操作复杂,需要大量的细胞,实验周期长且重复性差等。为了解决这些问题,2013年,美国斯坦福大学的William Greenleaf教授研发了一种全新的方法,利用Tn5转座酶结合高通量测序技术,来研究染色质可及性,即ATAC-seq。
图2. ATAC-seq技术工作原理图(2013,William J)。
ATAC-seq建库实验流程
裂解细胞,制取细胞核。常用的基础细胞裂解液,适用于人源、鼠源的细胞系。对于其他细胞系的裂解,可以在基础细胞裂解液中添加相应的成分。
打断基因组,获取目的片段。此模块需包含一个孵育测序接头的转座酶,近岸蛋白质可提供特殊优化的转座体(货号:N248),经过ATAC-seq实验证实,可以实现500-50000个细胞建库,核小体分布清晰、信噪比高、特异性强。
图3. 特殊优化的转座体在ATAC-seq实验中的应用
片段化之后,可以选择性的进行DNA提取。近岸蛋白质提供小片段DNA提取磁珠(货号:N245),该磁珠能够完整的保留40-100bp的小片段。
PCR将index连到目标片段上,完成文库构建。
ATAC-seq技术的应用
ATAC-seq技术比较成熟,天然的优势使其得到广泛的应用。自2013年以来,PubMed上与ATAC-seq直接关联文章搜索达4800余篇,其中不乏Nature、Science等顶级期刊杂志。现在就ATAC-seq的优势,简单了解一下它的应用。
相对于ChIP-seq、DNase-seq、MNase-seq等染色质开放区信息的探索技术,ATAC-seq技术的优势在于所需细胞量较低,而且信噪比高、特异性强、耗时短(约3h)。
图4. ATAC-seq与DNase-seq、MNase-seq的性能对比(2013,William J)
ATAC-seq技术经过后续的不断优化,已经满足动物、植物、人等样本的要求,具有很好的物种适应性。
图5. ATAC-seq技术在拟南芥(Robert J. Schmitz)(图5左)、人体T细胞(Howard Y Chang)(图5中)、 小鼠细胞( Longqi Liu)(图5右)中的应用。
单细胞测序技术是近几年研究的热点,通过对单个细胞的测序能够将表观遗传学研究个体化。常见的ChIP-seq、DNase-seq、MNase-seq等技术无法进行单细胞测序,而ATAC-seq经过实验验证,表明其能够进行单细胞测序。
ATAC-seq是一种高效探索染色质开放区的技术,适用于机制研究,探索信号通路、表型变化、疾病等与基因调控的相关性。并以其简便高效、重复性好等优点,成为研究染色质开放区的有效技术方法。
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Tsompana M, et al., Chromatinaccessibility: a window into the genome[J]. Epigenetics & chromatin, 2014.
Buenrostro, JD, et al., Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position[J], Nat Methods, 2013.
Ansuman T. S, et al., Transcript-indexed ATAC-seq for precision immune profiling[J], Nature Medicine, 2018.
Zefu L, et al., Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes[J], Nucleic Acids Research, 2017.
Chuanyu L, et al., An ATA C-seq atlas of chromatin accessibility in mouse tissues[J], Scientific Data, 2019.
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