第三代测序技术是指单分子实时测序技术,也叫从头测序技术。与前两代测序技术相比,其最大的特点就是单分子测序,测序过程无需进行PCR扩增,实现了对每一条DNA分子的单独测序。就当前形势来看,第二代短读长测序技术在测序市场上仍然占有绝对优势,但第三代测序技术近年来也发展的如火如荼,且已应用于基因组测序、甲基化研究和突变鉴定等多个研究领域。其中,英国牛津纳米孔公司所开发的纳米孔(Nanopore)测序技术便是三代测序中的中流砥柱。
Nanopore测序原理:纳米孔测序,顾名思义,核心就是利用一个纳米孔,孔内共价结合有分子接头,将纳米孔蛋白固定在电阻膜上后,再利用动力蛋白牵引核酸穿过纳米孔。当核酸通过纳米孔时使电荷发生变化,从而引起电阻膜上电流的变化。由于纳米孔的直径非常细小,仅允许单个核酸聚合物通过,而ATCG单个碱基的带电性质不一样,因此不同碱基通过蛋白纳米孔时对电流产生的干扰不同,通过实时监测并解码这些电流信号便可确定碱基序列,从而实现测序。
Nanopore测序中发挥着重要作用的几种物质:
图片来源:Oxford Nanopore Technologies官网
Reader——跨膜蛋白,可以嵌入到细胞膜中作为离子或分子通道的跨膜蛋白,具有天然的蛋白纳米孔。经过人为基因工程修饰后,得到Nanopore测序所需的Reader蛋白。
Membrane——多聚物薄膜,Reader蛋白会被嵌入到高电阻率的由人工合成的多聚物膜中,膜两侧是离子溶液,在两侧加不同的电位,离子就会在孔中流动,形成电流。
Motor——马达蛋白,在Nanopore文库构建时,需要在接头上连接一种马达蛋白,用于将DNA或RNA分子推入纳米孔中。
Tether——用于锚定DNA或RNA链,防止其在溶液中飘动,并使其进入纳米孔中。
Nanopore测序过程:解螺旋,将双链DNA解开成单链;DNA单链分子通过一个孔道蛋白,孔道中有个充当转换器的蛋白分子;DNA单分子停留在孔道中,有一些离子通过带来电流变化,而不同的碱基带来的电流变化不同;转化器蛋白分子感受5个碱基的电流变化;根据电流变化的频谱,应用模式识别算法得到碱基序列。
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