胆囊癌（GBC）是最常见的胆道恶性肿瘤，同时也是一种总体生存期较差的恶性肿瘤。.大多数GBC患者难以达到临床治愈，即使接受根治性手术切除，肿瘤复发的风险仍超过65％，总体5年生存率不到5％。截至目前，GBC发病机制和促进其癌变的分子基础研究还相对较少。

与其他类型的癌症不同，临床上只有30%的GBC患者可在术前被诊断，而更多的患者或者是在手术时被发现，或者病理检测手术标本时诊断。因此，若能在早期（T1）肿瘤阶段进行根治性切除，患者预后可显著改善，5年生存率达75％。因此，及早识别胆囊早期癌变、癌前病变将有效提高临床生存率。

低级别胆道上皮内瘤变（LG-BilIN）和高级别胆道上皮内瘤变（HG-BilIN）是两种常见的良性肿瘤息肉，因其存在潜在癌变风险而被认为是GBC的癌前病变。病理形态学研究发现，胆囊癌组织内可伴有BilIN的细胞成分。同时，分子层面的研究也表明，TP53和KRAS在LG-BilIN和GBC中通常发生突变，并且p16/cyclin-D1/CDK4细胞周期通路的失调也与胆囊异型增生和癌细胞均相关。已上观察结果均表明，胆囊中腺瘤及上皮内瘤变可能是癌前病变状态，可逐步演进发生成癌。但目前对BilIN如何发展成GBC的分子过程尚无更多研究，对癌前病变与癌细胞之间的分子进化关系也无明确定义。

近日，北京协和医院肝脏外科赵海涛教授团队、普瑞基准科技有限公司联合MD安德森癌症中心梁晗教授团队在Nature Communications杂志在线发表了题为“Genomic characterization of co-existing neoplasia and carcinoma lesions reveals distinct evolutionary paths of gallbladder cancer”的论文。研究团队从基因组层面描绘了同一患者来源的不同病变阶段组织的分子特征、进化关系和演进模式，对剖析胆囊上皮瘤变到癌变的分子过程提供了重要参考和新视角。

研究人员使用显微切割技术从多例胆囊癌患者中共存的胆囊癌、低级别胆道上皮内瘤变（LG-BilIN）、高级别胆道上皮内瘤变（HG-BilIN）和正常胆囊组织中分离不同病变阶段的组织样本，并进行全外显子测序。除了两例患者年龄在38外，其他患者的年龄均高于60岁。随后通过生物信息学分析等方法对样本的突变谱、突变分子特征及分子进化等层面进行深入分析。

图1. 胆囊上皮瘤变-癌变研究策略。来源：Nature Communications

首先，研究人员比较分析了三种胆囊病变的突变特征，结果发现GBC、 LG-BilIN和HG-BilIN的肿瘤突变负荷相似，无显著差异。来自两名年轻患者（P03和P11）的样本显示出比老年患者更少的突变数量，表明衰老可能是导致突变累积和促成癌变的主要因素。

图2. 三种类型胆囊肿瘤组织突变特征的比较。来源：Nature Communications

进一步分析发现，来自同一患者不同类型的样本通常表现出相似的突变特征，且在不同患者之间存在较大差异，提示潜在的突变机制更具患者特异性而非肿瘤类型特异性。为了解肿瘤发展过程中关键的体细胞突变，研究团队分析了潜在的体细胞突变驱动因素。在至少两名患者中，发现16个潜在的突变驱动因素。其中，11例患者中有5例检测到CTNNB1和ARID2突变，3例患者检测到TP53和ERBB3突变。

基因突变为癌症的进化提供了分子足迹，考虑到SNV体细胞突变的高可靠性，研究人员根据GBC、LG-和HG-BilIN的SNV突变推断它们之间的进化关系。利用两种独立的进化树构建方法（Treeomics和MEGAX），发现了两种不同的胆囊癌演化途径：癌细胞能够更早地产生分歧进行更加独立的演化，推测是源于在胆囊瘤变的初始阶段，大量的杂合性缺失（LOH）和突变事件导致癌性生态位的形成，从而致使通过BilIN非依赖性途径形成癌变 (BilIN-independent)；另一种是LOH、突变累积相对不足，会通过经典的腺瘤-不典型增生发展到癌的序列逐级模型来成癌（BilIN-dependent）。

图4. 基于SNV突变信息的系统发育树构建。来源：Nature Communications

更加有趣的是，虽然两组的突变数量和诊断年龄都非常相似，但BilIN-independent组从共同祖先中获得的突变数量显著高于依赖组。以上结果表明，影响GBC进化路径的是肿瘤发展早期积累的突变负荷，而不是GBC的总突变负荷。

图5. 两种演化模式下的突变信息比较。来源：Nature Communications

此外，基于染色体水平LOH状态的聚类模式分析在很大程度上重现了基于突变进化树拓扑关系的肿瘤分类。为了更深入地了解克隆进化，研究人员使用FACETS估计GBC-LG-BilIN-HG-BilIN样本的纯度和倍性，然后使用PyClone推断每个患者肿瘤进化的克隆数量。结果发现，与BilIN依赖组相比，BilIN独立组肿瘤包含的克隆明显更多，但没有包含更多数量的体细胞突变。

图6. LOH与克隆进化的比较。来源：Nature Communications

综上所述，该研究通过对来自同一患者不同类型的胆囊肿瘤（包括良性和恶性）的体细胞基因突变的基因组特征进行分析，揭示了GBC在胆囊息肉中进化的详细分子特征，并基于此构建了两种GBC发生发展的进化模型，表明胆囊肿瘤发展初期LOH事件和体细胞突变的积累程度是决定癌发展后续路径的关键。与之前基于对不同患者群体的癌前病变和癌组织的研究不同，该研究基于同一患者来源的不同组织类型样本提供了更为精准的分子信息和肿瘤演化模型。这些结果重新定义了领域内对胆囊癌的肿瘤转化和癌变进化轨迹的认识，为胆囊癌的早期诊断和有效治疗奠定了理论基础。

图7. 胆囊上皮瘤变-癌变进化模式示意图。来源：Nature Communications