科研

Nature Methods:两种新型CRISPR脱靶效应的分析方法

昨日,在Nature Methods同时刊登的两篇研究中,发表了两种分析CRISPR/Cas-9基因组编辑脱靶效应的新方法。其中一种方法可以鉴定细胞类型特异性SNP相关的脱靶突变,另一种则可以检测潜在脱靶切割位点。

第一项研究中,来自麻省综合医院(MGH)和哈弗大学的研究人员开发了一种通过测序体外检测切割效应的方法,称作CIRCLE-seq,该方法是一种高度灵敏的体外筛查法,比现有识别CRISPR/Cas9全基因组脱靶突变的细胞学或生化方法更有效。

“与之前的体外方法不同,我们所展示的CIRCLE-seq可以使用下一代测序技术,并且不需要参考基因组序列。”作者在文章提到,“更重要的是,CIRCLE-seq可以用来识别与细胞类型特异性SNP相关的脱靶突变,进而证明个性化的特异性分析的可行性和重要性。CIRCLE-seq提供了一种快速、全面可行的识别全基因组范围CRISPR/Cas9脱靶突变的方法。”

研究人员检测了新方法的灵敏性,将靶向HBB基因的sgRNA的脱靶结果与利用另一种方法Digenome-seq识别的脱靶结果进行比较。他们发现CIRCLE-seq鉴定出了Digenome-seq已检测到的29个位点中的26个,并且还检测到156个其他方法无法检测的新位点。

研究人员表示,“这些结果表明,与Digenome-seq 检测到的结果相比,CIRCLE-seq具有更高的信噪比,而且使用的测序reads减少了一百倍,这可能是由于该技术在识别全基因组范围脱靶位点方面具有更高的灵敏度。”

第二项研究中,来自驯鹿生物科学实验室和美国杜邦公司的研究人员描述了一种生化方法,称作SITE-Seq,该技术使用了sgRNA编程的Cas9对基因组DNA中的剪切位点序列进行识别。

“我们使用SITE-Seq检测靶向人类基因组的sgRNA与Cas9的特异性。识别的位点数量依赖于sgRNA序列和核苷酸浓度。低浓度条件下鉴定到的位点更有可能是细胞中的脱靶突变。”研究小组说,“细胞中具有活性的脱靶位点会受到sgRNP传递、细胞类型和在核苷酸环境接触的持续时间影响。总而言之,我们的结果强调了在评估核苷酸活性和特异性时,将全面的脱靶位点生化识别方法与基于细胞的活性检测方法结合的有效性。”

SITE-Seq过程包括了选择性的标记、富集、测序,以及将将切割后的基因组DNA与对应的参考基因组比对。最终比对结果中,sgRNP切割产生的位点会生成一个特殊的信号,可以通过计算检测,研究人员还表示,这个信号与Digenome-seq.检测到的信号相似。

此外,研究人员在Cas9消化处理的人类胚肾基因组DNA中检测了该方法,结果发现SITE-Seq靶向的771个生化切割位点。研究人员接下来将AAVS1 sgRNA转染到稳定表达Cas9–GFP 的HEK293细胞中,3天后进行脱靶编辑。他们从最初的771个包含大范围核苷酸替换的位点中选择了68个位点进行评估,发现29个细胞脱靶位点的突变频率在0.1%~66.6%。

研究小组在文章提到,“综合考虑,这些数据表明SITE-Seq可以确保检测到所有的sgRNP生化切割位点,进而精确定位这些在细胞环境中积累了脱靶突变的靶点。”

Caribou公司总裁兼CEO Rachel Haurwitz 表示,“这项研究证明CRISPR-Cas9是一种安全且有效的基因编辑工具。通过向研究人员提供一种精确定位CRISPR–Cas9活性的基因组区域,我们可以选择活性和特性行最高的靶点来减少脱靶效应的发生。”

参考文献:

https://www.genomeweb.com/gene-silencinggene-editing/researchers-publish-two-new-methods-analysis-crispr-target-effects

https://www.nature.com/nmeth/journal/vaop/ncurrent/full/nmeth.4278.html

http://www.nature.com/nmeth/journal/vaop/ncurrent/full/nmeth.4284.html

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本文由 测序中国 作者:白云 发表,转载请注明来源!

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