近年来，虽然癌症的诊断和治疗取得了长足进步，但转移性癌症患者的预后仍然很差，转移性疾病占癌症相关死亡的绝大多数。癌细胞从原发性肿瘤向远处器官的扩散是一个有序的、多步骤过程，称为侵袭转移级联反应。在过去的十年中，长非编码RNA（lncRNAs）的发现和表征揭示了其调控作用的多样性，在整个转移级联反应中也具有关键作用。
近日，美国加州大学、华盛顿大学等研究团队联合在Nature Reviews Cancer上发表了题为“Long noncoding RNAs in cancer metastasis”的综述文章。文章针对lncRNAs在肿瘤转移中的研究现状，回顾了lncRNAs如何通过在促转移步骤中发挥作用，如何通过影响转移性肿瘤的微环境来促进转移，证明了lncRNAs在肿瘤转移中的作用。研究团队阐明了lncRNAs功能的新发现，还讨论了lncRNAs在生物学中面临的争议和挑战，提出了该领域的未来研究方向。小编对该综述内容进行了简要整理。
文章发表于Nature Reviews Cancer
数以万计的lncRNAs已通过高通量RNA测序鉴定出来。经修饰的反义寡核苷酸（ASO）和 CRISPR-Cas9及其衍生物等新工具改变了lncRNA研究的方式。通过对肿瘤样本的差异表达分析和比较转录组学研究，揭示了多种lncRNAs表型和机制多样性。已有研究结果显示，LncRNAs在基因调控中起着重要作用，包括调节基因激活、X染色体失活、选择性剪接和翻译后调控。LncRNAs通过多种不同的机制发挥这些功能（图1）。
LncRNAs作为癌症通路的关键调节因子，同时也是疾病的生物标志物。LncRNAs已经在癌症的大多数经典标志背景下进行了描述——持续增殖信号、逃避生长抑制因子、抵抗细胞死亡、基因组永生式复制、诱导血管生成以及激活侵袭和转移（图1）。重要的是，与蛋白质编码基因一样，基因改变是肿瘤发生的基础，lncRNA也会在恶性肿瘤中发生扩增、删失或突变。很多lncRNA位于肿瘤基因组中重复发生拷贝数变异的区域，其中包括FAL1，其基因组的扩增可抑制生长抑制基因CDKN1A。lncRNAs涉及的遗传和表观遗传改变可能解释了早期癌症基因组中驱动突变的罕见性，目前相关研究集中在蛋白质编码基因上。与蛋白质编码基因不同的是，lncRNAs的调控机制是多种多样的。
图1.癌症中的lncRNAs。来源：Nature Reviews Cancer
局部侵袭与EMT
局部侵袭周围的正常组织是肿瘤转移的必要步骤。上皮间充质转化（EMT）是胚胎发育和组织稳态中正常激活的过程，可以确保组织和器官适当形态的发生，对执行侵袭转移级联反应至关重要。通过激活主要调节因子如SNAI1、TWIST1和ZEB1，具有上皮表型的癌症细胞被赋予间充质细胞的特征，允许侵袭、内渗和向远处扩散（图2）。
图2.lncRNAs参与侵袭转移级联反应的多个过程。来源：Nature Reviews Cancer
H19是最早被详细研究的lncRNAs之一。H19在多种癌症中过表达，并参与肿瘤细胞侵袭（图3）。一直以来，H19在间充质亚型结直肠癌细胞中的表达高于上皮亚型。但在循环肿瘤细胞（CTCs）中，H19对miRNA let-7b有不同的吸附作用，导致CYTH3的去表达，从而促进间充质表型，突出了环境背景对lncRNA功能的显著影响。表明H19在细胞和环境的基础上协调了癌细胞转移起始和定植的逐步级联，具有潜在的不同作用机制。
lncRNAs与已知的EMT主调节因子（如TGFβ）相互作用, 以增强或抑制转移潜能。这些相互作用可能通过核糖核蛋白复合物直接发生，也可能通过表观遗传调控因子或miRNA隔离间接发生。与lncRNAs干扰TGFβ信号和转录EMT途径相反，STAT3、shRNA等通过替代途径调控EMT（图3）。
图3.lncRNAs通过多种途径调控肿瘤转移。来源：Nature Reviews Cancer
另外几个lncRNAs也与EMT有关。其中，前转换相关RNA（PTAR）已被证明与卵巢癌的间充质亚型相关，并且PTAR作为针对miR-101的ceRNA，可抑制ZEB1的表达。lncRNA-PNUTS是从一个产生lncRNA变体（lncRNA-PNUTS）和mRNA变体（PNUTS）的基因座转录而来的。当lncRNA起ceRNA的作用时，mRNA产生蛋白磷酸酶的调节因子1。LncRNA被TGF-β激活（lncRNA-ATB）为另一种ceRNA，可作为TGFβ–ZEB1/ZEB2轴的调节因子。作为TGF-β的转录靶点, lncRNA-ATB竞争性地结合到miR-200家族，导致ZEB1/ZEB2的上调。同样在HCC细胞中，lncRNA ZFAS1在基因组DNA水平扩增。LncRNA NORAD最初是通过分离细胞质Pumilio蛋白来维持基因组稳定性，在癌症的侵袭和转移中发挥作用（图4）。
如上所述，PTAR、lncRNA-PNUTS和lncRNA-ATB已被证明在多种癌症类型中发挥作用。当这些lncRNAs被进一步探究时，研究人员发现在不同癌症类型中均具有的其他机制。
图4.转移相关的lncRNAs受多种上游机制调控。来源：Nature Reviews Cancer
癌细胞转移定植的调控
恶性肿瘤细胞通过侵袭性和间充质表型转化逃脱原发肿瘤，必须通过血液内渗进入血液循环，并在远端外渗并定居。其中一些lncRNAs参与了促进转移癌细胞在远端器官位点定植和扩增。
MALAT1是最早在肿瘤转移过程中被描述的lncRNAs之一，与肺癌转移相关。在多瘤病毒中间T抗原（PyMT）模型中，启动子缺失或ASO介导的MALAT1基因敲除导致肺转移形成减少。MALAT1可以通过定位于核斑点和基于这些初始表征改变共转录选择性剪接来调节这些功能。在转移性非小细胞肺癌的小鼠模型中，皮下注射MALAT1 ASO可减轻肺结节的负担，表明MALAT1具有靶向治疗转移性肺癌的潜力。在一项研究中，研究人员发现MALAT1可以结合并灭活前转移TEAD转录因子家族的转录活性，这可能导致ITGB4和VEGFA表达的降低。以上不同的结果表明，lncRNA功能的表型可能不仅取决于细胞环境，还取决于作用的主导机制。
HOX基因的lncRNA HOTAIR是一个研究相对成熟的癌细胞转移调节因子，也是最早进行癌症转移研究的lncRNAs之一，被发现促进不同类型癌症的转移。在结直肠癌患者中，HOTAIR高表达与肝转移相关。HOTAIR在非转移性SK-BR3乳腺癌细胞和具有转移能力的MDA-MB-231细胞中的异位表达可导致小鼠尾静脉注射后肺定植，且MDA-MB-231细胞表现出持续的癌细胞转移定植和扩张。
特定位点向性的调控
因为特定的器官环境更适合播散性肿瘤细胞的存活，因此转移癌细胞表现出位置特异性。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，对于该类型肿瘤是如何引起远端器官的非随机性转移我们还知之甚少。已有研究发现，某些lncRNAs对这些器官具有诱导性，其原理可能适用于其他原发性恶性肿瘤中的lncRNAs（图5）。
在原发性乳腺癌的骨转移瘤中，恶性肿瘤细胞分泌的CTGF通过激活破骨细胞中的YAP通路，诱导分化和骨溶解，从而促进骨转移定植。使用高通量RNA干扰（RNAi）筛选，结果表明，在MCF-7乳腺癌细胞中，YAP1的激活可能需要lncRNA MAYA 。有研究显示，人乳腺癌骨转移细胞（BoM-1833）中MAYA基因的敲除导致CTGF分泌的减少，从而损害癌细胞诱导的破骨细胞分化和骨吸收。表明靶向MAYA的治疗方法是治疗骨转移的一个潜在有效方法。
与骨转移相比，转移到中枢神经系统的乳腺癌细胞可利用不同的途径来实现位点特异性定植。来源于原发性乳腺癌的脑转移瘤表达L1细胞粘附分子(L1CAM)来拉拢（co-opt）血管内皮，使转移瘤在整个大脑内生长。
Lnc-BM是一种在脑转移瘤中富集的lncRNA，而非来源于原位导入乳腺癌细胞的肺或骨转移瘤（图5）。Lnc-BM的表达与患者的生存期成反比，并与肿瘤在中枢神经系统中的复发呈正相关。通过心内注射去除lnc-BM的乳腺癌细胞（通过RNAi或CRISPR-Cas9）的小鼠，其脑转移的负荷降低，且癌细胞在脑内血管部位的增殖也减少。从机制上讲，lnc-BM通过STAT1/3的磷酸化激活ICAM1的表达，从而允许恶性细胞以类似于L1CAM的方式募集脑内皮细胞。一旦癌细胞在脑内定植，lnc-BM就可介导JAK2的激活，通过CCL2招募巨噬细胞，从而调节有利于脑转移的多种信号通路。
图5.lncRNAs在转移部位特异性取向中的作用。来源：Nature Reviews Cancer
由于lncRNAs的表达和功能通常具有细胞类型的特异性（除了MALAT1和XIST等明显的例外），因此，lncRNAs可在癌症转移的器官特异性倾向中发挥重要作用也许并不奇怪。但目前还不清楚特定部位的lncRNA调控过程是否在转移性定植前就被触发，从而主导细胞命运。或者说，lncRNAs可能通过微环境对转移性克隆的维持产生影响。
转移微环境中的lncRNAs
转移细胞到达远处器官后，形成TME并与之相互作用，TME包括多种过程，包括血管生成、抑制和/或协同先天性和适应性免疫系统。转移细胞的生长需要建立和维持支持性微环境，包括常驻基质细胞、先天和适应性免疫细胞。通过抑制免疫系统、血管生成的招募、旁分泌信号和前转移细胞外基质的沉积，TME以多种方式促进癌症转移。lncRNAs在肿瘤和转移微环境中的作用正在显现（图6）。
最初发现NF-κB-interacting lncRNA（NKILA）是一种细胞质lncRNA，可直接抑制乳腺癌细胞内的NF-κB复合物，下调后导致转移潜能增加（图6a）。在乳腺肿瘤浸润的T细胞中，NKILA抑制NF-κB信号转导，导致激活诱导的T细胞死亡。NKILA在肿瘤细胞和免疫细胞中负调控NF-κB通路，lncRNA CamK-A在乳腺癌细胞中通过IκB降解来激活NF-κB通路，以应对缺氧诱导的钙流入（图6b）。
在CD4+T细胞中，lnc-EGFR与细胞质EGFR结合，从而稳定其下游信号转导。在膀胱癌中，LNMAT1在淋巴结阳性膀胱癌中过度表达，是膀胱癌患者总生存率的一项预后指标。LNMAT1的功能不是肿瘤细胞固有的，因为来自LNMAT1转导的膀胱癌细胞的条件培养基能够刺激巨噬细胞活化，并且这种效应可以被CCL2中和抗体消除（图6c）。
LncRNAs是祖细胞、先天和适应性免疫细胞分化和功能的关键调节因子。同时，lncRNAs对于神经、肺、心脏和胚胎组织的发育和生理功能也是必要的。由于所有这些细胞类型都能影响转移性微环境或转移前生态环境，因此或有更多的lncRNAs也会参与其中。
lncRNAs在转移中的转化潜力
由于转移性癌症患者的存活率较低，对治疗的抵抗仍然是该类患者治疗过程中的一个主要障碍。改善癌症治疗的一个重要方法是利用组织和癌症特异性表达谱来，开发可预测从原发疾病到转移性疾病进展的生物标志物。
图6.lncRNAs与肿瘤微环境。来源：Nature Reviews Cancer
目前lncRNA PCA3已被确定为前列腺癌的无创性早期诊断标志物，具有可靠的检测特性用于临床。有研究结果显示，lncRNA SChLAP1的过表达对前列腺切除术后10年内发生前列腺癌转移具有独立预测作用。在手术时将SChLAP1的检测应用于患者的风险分层，有助于精准医疗策略的实施。但是也有研究表明，SChLAP1在前列腺癌转移中的作用机制与SWI/SNF无关。SChLAP1的机制有可能是背景或细胞类型的特异性，同时仍然保持作为临床预后指标的效用。
在转移性肾细胞癌（RCC）患者中，与lncARSR表达水平低的肿瘤相比，lncARSR高表达预示患者的总生存期较短。lncARSR可通过隔离miR-34和miR-449，导致AXL和MET表达发生去抑制（derepression），从而导致对舒尼替尼的抗性。
值得注意的是，迄今为止所讨论的生物标志物的发现可能仍处于早期阶段。许多具有癌症或组织特异性表达的lncRNAs可能并没有足以作为可靠生物标志物使用的高表达水平。展望未来，越来越多的转录组测序数据将及大地促进lncRNA生物标志物的发现。
目前只有一部分芯片平台包含有监测RAMS11和SChLAP1表达的探针，以能够在具有长期临床结局数据的患者人群中进行独立验证。但许多lncRNAs不会被任何现有的芯片平台所捕获到。此外，lncRNA生物标志物的开发还需要较长时间的随访和临床信息记录。由于患者病情发展和对治疗反应的复杂机制，单一的lncRNA可能不是最有用的生物标志物，而是需要与蛋白编码基因一起来进行评估。
通过体内转移性疾病的临床前模型，lncRNAs已经显示出了作为癌症治疗靶标的前景。例如上文提到的lncRNAs MAYA、MALAT1和lncARSR，都是使用ASO进行体内沉默的靶标，以减轻小鼠模型中转移性疾病的负荷。但当使用ASO疗法靶向lncRNAs时，确保只发生最小的脱靶效应至关重要，鉴于体内lncRNA转录本的丰度通常较低，这可能会带来进一步的研究问题。
新的研究证据表明，除了RNase H所介导的成熟RNA发生降解外，ASO还可通过过早的转录终止来破坏目标RNA，因此在预测ASO疗法的活性时需要考虑这一点。某些ASO也被观察到有肝毒性，ASO的化学修饰已被证明可以减轻这种毒性和脱靶效应。
虽然面临上述挑战，但令人欣慰的是，在癌症小鼠模型和临床试验中，蛋白编码基因已成为靶标，如脊髓性肌肉萎缩症患者的SMN2、难治性淋巴瘤的STAT3和克罗恩病的SMAD7。未来，靶向lncRNAs治疗癌症转移的愿景也变得很有希望。
目前的局限性
虽然许多研究证明了lncRNAs在整个转移过程中的作用，但在细胞转化和远处定植之间的侵袭-转移级联反应步骤中，包括外渗、血源性扩散、内渗和微转移的形成，lncRNAs的作用还未明确。此外，文中讨论的大多数lncRNA都能增强转移潜能，这些观察结果能否代表lncRNA生物学的固有属性很难确定，lncRNA在不同癌症类型转移中的作用也难以概括。因此，需要对lncRNA进行更多的研究。
同时，为什么看似不同的lncRNA会在几个稳定的蛋白质编码通路上聚集，而不是作为独立的转移调节因子发挥作用？几十年来，人们对蛋白编码基因的研究集中于关键的转移调节基因，对许多lncRNAs研究仍处于比较初级的阶段，类似的lncRNA还没有被发现和独立验证。此外，多种RNA种类与蛋白编码基因相互作用时有可能发挥着类似的角色。即使是由基因组中不同位置产生的具有不同序列的lncRNAs，也可以影响一组类似的有效转移通路。
结 语
综上，LncRNAs不仅是癌症标志的重要调节因子，在癌症转移机制中也具有关键作用。近年来，随着更多的lncRNAs被表征，通过与促进或抗转移的蛋白复合物一起发挥作用，或直接与其他RNA类型或DNA相互作用（如RNA-DNA三螺旋），lncRNAs可通过不同的机制对癌症通路产生影响。但悬而未决的问题依然存在，例如lncRNAs在CTCs中的作用、在转移前生态环境的形成和在基质细胞中的特定功能。未来的研究需要进一步明确lncRNAs参与转移的机制。
展望未来，除了选择合适的模型来灭活lncRNA，实验室进行适当的基因回复实验以及不同研究结果的独立验证都是必要的。了解各种方法对解释lncRNA功能的影响也至关重要，同时我们需要对lncRNA功能的各种可能性保持开放的心态。
LncRNAs作为新的诊断和预后工具，已成为一种新型治疗靶点，为组织癌症转移的临床治疗提供了新机会。随着lncRNAs体内靶向技术的成熟，将极大地促进可靶向转移瘤lncRNA疗法的实现。
参考文献：
Liu, S.J., Dang, H.X., Lim, D.A. et al. Long noncoding RNAs in cancer metastasis. Nat Rev Cancer (2021). https://doi.org/10.1038/s41568-021-00353-1
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