2016年，燃石医学开始布局癌症早检领域，聚焦泛癌种早检，将液体活检技术、二代基因测序（next generation sequencing，简称NGS）、表观遗传学与机器学习等创新性融合，致力于实现一管血精准检测多个癌种。
2021年6月15日，燃石医学泛癌种早检技术ELSA-seq正式在《自然·生物医学工程》（Nature Biomedical Engineering，IF: 18.952）发表，文章题为“Ultrasensitive detection of circulating tumour DNA via deep methylation sequencing aided by machine learning（机器学习辅助的深度甲基化测序对循环肿瘤DNA的超灵敏检测）”。
燃石医学与北京协和医院和上海胸科医院等机构合作，揭秘了ELSA-seq技术如何准确捕捉血液中来自早期肿瘤的微弱信号的技术原理，并且通过在肺癌双中心队列中的独立验证数据，形成ELSA-seq技术应用于泛癌早检和组织溯源的能力背书。
图1. Nature Biomedical Engineering文章发表截图。
共一作者：梁乃新教授（北京协和医院）；李冰思博士（燃石医学）。
共同通讯作者：李单青教授（北京协和医院）；赵珩教授（上海交通大学附属胸科医院），张之宏博士（燃石医学）。
血浆样本中低丰度的循环肿瘤DNA（ctDNA）一直是突破癌症早检的难点，随着表观遗传学的加入，多组学分子信号与机器学习的结合开始让我们触碰到泛癌种早检的可能。在人类面临的众多癌症难题中，肺癌不同于天然会向血液中释放更多游离DNA的其他癌种，如肝癌和血液肿瘤，或者与正常组织特异性差异非常明显的癌种，如肠癌（表观遗传学变化更为丰富），这导致肺癌早检在生物学层面尤为困难。同时，肺癌作为全球发病率和致死率居于首位的癌种，形成了泛癌种早检应用的瓶颈。这也是我们为什么频频看到肠癌与肝癌早检技术的验证数据，但肺癌数据寥寥无几。从一定程度来说，攻破肺癌早检就能跨越多癌种早检应用最重要的一个门槛。
ELSA-seq技术为何获得Nature子刊的发表？技术与算法的创新、可靠的独立验证队列是获得认可的关键。
ELSA-seq技术揭秘之一：“燃石鹰眼” – 将单碱基分辨率做到极致
凭借单碱基分辨率的测序精度，全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）已经成为了业内甲基化测序的金标准，但此方法对DNA的破坏，使其临床应用严重受限。ELSA-seq依靠分子生物学和生物信息学的设计呼应，在上游实现了极少量的血浆中游离DNA的高效回收和利用，在下游致力于信噪窗口分离。
图2. ELSA-seq技术总览（样本制备→文库制备→深度测序→降噪处理→特征选择→机器学习）。
图3. ELSA-seq与主流商用试剂盒性能比对有明显的提升。
图4. 在没有（d）或有（e）深度测序降噪的情况下，不同测序仪均观测到碱基错误率降低10倍。
ELSA-seq技术揭秘之二：“飞花摘叶” – 精准的靶向捕获只留下有效信息
ELSA-seq的核心是在极微量的DNA中精准捕捉与癌症信号相关的甲基化片段，它的独到之处正是信号的高保真放大和高效率捕获。在cfDNA投入量仅为2 ng时（相当于1ml健康人血浆样本含量），ELSA-seq实现了DNA扩增与均一性捕获的两全：60%~80% reads可以被准确的比对在靶向区域上，并且90%以上的区域被>200 reads覆盖。
图5. ELSA-seq panel设计和靶向捕获性能表现。
ELSA-seq技术揭秘之三：“借力打力”：从locus到准确的block，诞生MBS（methylation block score）新型算法
传统的DNA甲基化分析主要基于单独位点甲基化变异来捕捉信号（iAF），该方法对测序深度和单点错误率非常敏感。为此，燃石医学基于ELSA-seq开发了一种对相邻甲基化位点的基因组距离和甲基化水平进行加权计算的打分系统，可对基因组进行区域划分（下图a）。通过对肺癌特征性的SHOX2基因的甲基化变异检测可以看出，区域统计量（mAF）比位点统计量iAF具有更好的识别肺癌信号的能力（下图b）。
此外，ELSA-seq用一种新的测量统计量“甲基化区域评分（MBS）”带来了更高的信噪比。如下图d所示，即使是低至1‰的样本掺比，MBS也可以实现与阴性对照的明显区分。
图6. ELSA-seq甲基化block定义和性能验证。
说了这么多，是时候看看ELSA-seq的表现了，在低至万分之五以上的癌细胞DNA含量样本中，ELSA-seq可以近乎完美地定量癌症信号（r2=0.99）；在癌细胞DNA含量低至万分之一时，依然可以显著区分癌症与对照样本。在同样的一组样本中，研究者比对了ELSA-seq与代表液体活检最高灵敏度的两种方法学：NGS和ddPCR，ELSA-seq对比后两者灵敏度超越10倍以上，呈现了碾压性的优势。
图7. ELSA-seq性能验证结果。
作为 ELSA-seq 的临床效用的最终检验，来自北京协和医院和上海胸科医院的研究者分别招募了两个完全独立的肺癌患者队列，进行了早检模型的训练/验证，以及锁定模型后独立队列的单盲测试，实验同时设置了跨技术平台对比亚组，进行甲基化信号（ELSA-seq）与突变信号（NGS）“头对头”的比较。这个“终极大考”的答卷如下：
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ELSA-seq实现了有效的低频信号建模和过拟合风险控制：独立队列1和队列2分类准确度（AUC: 0.93 vs 0.90）高度一致；
- 多变量分析显示检测ELSA-seq模型打分的高低与肿瘤分期、肿瘤大小和组织学亚型高度相关，其中肺鳞癌亚型平均得分显著高于肺腺癌；
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对于所有的血浆样本，在96%的整体特异性下，IA期-III期肺癌患者的灵敏度达到52%-81%；
- 甲基化信号可检测到低至0.02%突变丰度的血液样本，且甲基化信号成功识别的肺癌患者数量几乎是NGS突变信号识别的两倍（48/66 vs 28/66），同时保持同样的超低假阳性率（0/49），值得一提的是，两者的联合检测可以达到更高的阳性率（54/66）。
ELSA-seq诞生于2017年，在2018年的CSCO第一次发布数据，距今已有三年的时间。在这篇文章成文、打磨、投稿、修回的漫长的三年里，燃石的研发团队又把ELSA-seq进行了数次的迭代，在2020年的ESMO Asia大会口头报告中，来自复旦大学附属中山医院的研究者汇报了最新一代ELSA-seq技术在肺癌、肠癌、肝癌、食管癌、卵巢癌、以及胰腺癌六个癌种中的验证数据，ELSA-seq的检测特异性也从本文的96%进一步推高到98%以上，并且呈现了高达82%准确性的组织溯源能力。在此基础上，两个前瞻性早检万人研究“PREDICT”和“PRESCIENT”亦已开启。本文的一图一表一字一句记录了ELSA-seq最初的模样，而在文章之外，它已经以呼啸而过的速度长出了本文所描画的图景。这正是癌症早检技术生长的速度，是燃石的速度。
未来，燃石期待与医学界的专家们一道努力，一如既往不遗余力地推动癌症早检产品的研发和落地，为癌症患者大幅延长生存时间和提高生命质量贡献中国科技创新的力量。
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