前言 

作为基因治疗的明星载体，腺相关病毒基因组(AAV)备受关注，但它的反向末端重复序列(ITR)能形成高度稳定的二级结构，利用现有技术很难进行序列验证。为了突破这重障碍，GENEWIZ创研自主知识产权技术，运用原创的测序方法，清晰地分析这些复杂序列，助力研发人员有效地评估ITR区域的完整性。另外，针对ITR易缺失的特性，GENEWIZ开发了一套针对rAAV质粒构建、错误ITR的修复和rAAV质粒大量制备的方法——Hi-Fi技术，较现有的方法更能使rAAV质粒的ITR在细菌中扩增过程中保持稳定，不易再发生缺失。

一、基因治疗

基因治疗（Gene Therapy）是指将外源基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷或基因表达异常引起的疾病。近年来，基因治疗不断取得重大突破。去年，美国FDA批准了诺华旗下的AveXis Inc.公司开发的Zolgensma（onasemnogene abeparvovec-xioi），被称为基因治疗的又一里程碑。基因治疗产品成为面临绝症、死亡病人的生命之光，为他们的未来带来了希望。

而腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）载体作为基因治疗的明星载体，是基因治疗的好帮手；2017年11月，《新英格兰医学杂志》发表了一项临床试验结果：重组AAV基因治疗成功延长了15名身患严重遗传性疾病-1型脊髓性肌萎缩症（SMA1）患儿的生命，让他们有机会重获健康；2019年5月，《Nature Reviews Drug Discovery》上发表一篇综述，马萨诸塞大学医学院（University of Massachusetts）的基因疗法专家高光坪教授对AAV进行了详细的介绍。

50年AAV时间线（图片来源：Nature Reviews Drug Discovery ）

二、AAV背景介绍

AAV是一种单链DNA病毒，属于细小病毒科，Dependoparvovirus属。它的生命周期依赖于辅助病毒的存在，例如AdV。AAV存在于多种脊椎动物中，包括人类和非人类灵长类动物(NHP)。目前的共识认为AAV不会引起任何人类疾病。

它由直径约26nm的二十面体蛋白质衣壳和~4.7 kb的单链DNA基因组组成。衣壳包含三种类型的亚基VP1、VP2和VP3，总共60种拷贝，比例为1:1:10(VP1:VP2:VP3)。基因组的两端是两个T形反向末端重复序列(ITR)，这两个ITR是AAV的DNA自我复制的起点以及触发病毒包装的信号，在病毒的复制和包装过程中起着关键作用，并且参与了病毒基因组在宿主基因组上的整合和逃逸过程。

图1 AAV和AAV载体的基因组结构（图片来源：Semantic Scholar）

图2 AAV2的ITR序列的示意图。ITR由两个回文臂(B-B'和C-C')和一个长茎回文(A-A')组成。D序列在AAV基因组的每一端只出现一次。

三、AAV-ITR区域突变检测挑战

然而，在使用大肠杆菌进行质粒扩增过程中，AAV质粒的ITR区域经常发生突变。研究表明，ITR序列的不同区段缺失，都会对rAAV的产生造成影响。

以目前的技术，通过限制性内切酶的酶切反应可以研究ITR的定位及其完整性。但凝胶电泳的分辨率较低，很难检测到点突变或小缺失。直接对ITR区域进行测序可以提供足够的分辨率，但是由高GC含量和长的回文序列（>100bp）组成的T型发夹结构会抑制普通Sanger测序试剂盒中的聚合酶链式反应，导致测序失败。

由于二级结构在线性模板中不稳定，所以通过PCR扩增ITR区域，然后对扩增产物进行测序可以得到更好的结果。然而，这种两步法的测序需要特殊的引物设计和循环设置。并且这种检测方法对于ITR区域的两端的序列要求较高，成功率也不能保证。

四、解决方案

为了解决这一难题，GENEWIZ开发的新型专利ITR测序方法，可以改善ITR区域的测序信号并延长读取长度。数据对比如下：

1. 标准方法：使用T公司的测序试剂盒对含有AAV2 ITR的质粒进行测序。结果显示，在ITR发夹结构开始处，测序信号突然下降(图3），导致测序过早终止。

 

图3 使用T公司测序试剂盒对AAV2的ITR区域进行测序。红色下划线标记序列后的碱基“CACATGT”是一个无法成功测序的ITR发夹结构的开端。

2. GENEWIZ新型AAV-ITR专利测序方法，结果显示ITR发夹结构可以测通并且在整个ITR区域没有明显的信号损失，达到了与常规测序反应类似的读取长度(图4)。

图4 使用GENEWIZ AAV-ITR测序法测定AAV2的ITR区域的色谱图。红色下划线的序列表示图3中提到的相同序列。红框内显示完整的ITR发夹结构。

此外，对rAAV质粒中ITR完整性的定性评价，结果依旧令人满意。目前，rAAV质粒主要在细菌中扩增。然而，由于细菌中同源重组系统，ITR经常发生重排。细菌繁殖后，rAAV质粒中最常见的突变之一是ITR的B-B’或C-C’臂缺失。这种缺失使T型ITR发夹的茎更长，比野生型ITR更加稳定。在对数百条来自不同细菌细胞系中扩增的rAAV质粒进行测序后，结果发现，GENEWIZ AAV-ITR测序方法可以测通野生型ITR序列(图5和图6A)以及更有挑战性的缺失突变的ITR序列(图6B)，并且能帮助定性评估ITR区域甚至是被部分截断的ITR区域的完整性。

图5：AAV2的ITR区域中B-B’臂缺失的示意图。野生型AAV2的ITR区域是一个125bp的T型发夹结构，而缺失突变的ITR是一个103bp的发夹结构，其茎部更长。

图6：利用GENEWIZ AAV-ITR测序方法分析rAAV质粒中ITRs的完整性。A) GENEWIZ AAV-ITR测序法测定野生型AAV2 的ITR区域的色谱图。C-C’臂和B-B’臂分别用红色和蓝色标出。B) GENEWIZ AAV-ITR测序法对AAV2的缺失突变ITR区域进行色谱分析。测序结果显示B-B’臂出现缺失。C) GENEWIZ AAV-ITR测序法测定缺失突变的AAV2 ITR区域的色谱图。测序结果表明，该质粒是完整ITR和缺失突变ITR的混合物。在155-157bp处的TTT峰与完整的ITR序列一致，其中存在缺少B-B’臂的质粒模板。

五、GENEWIZ AAV-ITR测序方法的优化

一些rAAV质粒在ITR区域的5’端前部含有一个同聚物G区域(图7A)。伴随着Poly-G的测序过程，测序信号值也逐渐降低，并导致未测序至ITR发夹结构测序反应就提前终止 (图7B)。现有的Sanger测序方法不能解决poly-G区域对ITR发夹结构造成的热力学障碍。但是，GENEWIZ的AAV-ITR测序方法能通过反向测通ITR发夹结构和poly-C重复区域(图7A)，进而提高该区域的数据质量及读取长度(图7C)。

图7：GENEWIZ的AAV-ITR测序法对含有poly-G序列的AAV质粒进行测序。 A) ITR区域的5’端前部含有一个同聚物G区域的示意图；黑色和绿色箭头分别表示正向测序和反向测序。B)采用GENEWIZ的AAV-ITR测序法，正向对同聚物G + ITR区域进行测序的色谱图。C)采用GENEWIZ的AAV-ITR测序法，反向对同聚物G + ITR区域进行测序的色谱图。

GENEWIZ的AAV-ITR测序方法能有效评估AAV质粒中ITR区域的完整性。它可以迅速准确地检测到ITR区域的突变，为下游故障的排除节省时间和精力。这种ITR区域的测序方法也将广泛应用于热力学稳定的发夹结构的测序。

金唯智美国客户反馈

七、ITR易缺失解决方案对比

另外，针对ITR易缺失的特性，科学家们一直努力寻找能使rAAV质粒的ITR在细菌中保持稳定扩增的方法，现在市场上使用较多的方法是通过使用特殊的大肠杆菌细胞来保持其稳定。市场上目前反馈比较好的，有来源于I公司的S13和S14，它被设计为专门克隆不稳定基因（如包括有正向重复的慢病毒DNA），还有很多客户根据在多年AAV方面研究的经验，也会使用B83 (来源于A公司)、D10(来源于I公司)和S2(来源于A公司)等大肠杆菌细胞。

GENEWIZ通过专利的ITR测序方法（该方法可以测通野生型ITR序列以及更有挑战性的缺失突变的ITR序列，能帮助定性评估ITR区域甚至是缺失突变ITR区域的完整性）和大量的rAAV质粒构建经验，发现这些细胞的效能也是有限的，并不能普遍稳定不同的rAAV质粒（表1）。

八、GENEWIZ解决方案

为此，GENEWIZ开发了一套针对rAAV质粒构建、错误ITR的修复和rAAV质粒大量制备的方法——Hi-Fi技术，该方法的核心点不仅仅是制定了更简单、灵活和快速的克隆方案，而更重要的是发明了一种特殊的大肠杆菌细胞及其配套使用的AAV稳定剂，较现有的方法更能使rAAV质粒的ITR在细菌中扩增过程中保持稳定，不易再发生缺失（表1）。

 表1：5个随机AAV构建后ITR的正确性

基于感受态细胞的对比数据，我们进一步探索了Hi-Fi技术流程在转化筛选正确克隆过程中的能力。由于ITR本身的不稳定性，在质粒构建的过程中，会有发生突变的可能性。

原始质粒：

第一次转化结果：

目前金唯智基于Hi-Fi技术可以提供rAAV的质粒构建，ITR区域的修复和rAAV质粒大量制备以及AAV病毒包装等相关服务。

九、金唯智Hi-Fi技术流程

01、AAV载体构建

02、ITR区域修复

十、金唯智rAAV的质粒构建特点

• 先进的合成技术：可以合成高难度重复序列，高GC含量的困难序列以及含有发夹结构的ITR区域。
• 质量可靠：酶切和测序双重检测，金唯智自主研发的ITR测序技术能够测通ITR区域，确保序列100%正确。
• 免费的表达系统优化：可以根据表达系统对目的基因进行密码子优化。
• 周期短：rAAV-ITR载体构建最快仅需8-12天；
• 完善的服务流程：可以提供从基因合成，载体构建到病毒包装的一站式服务。

图8 AAV2载体

案例分享

项目类型：Hi-Fi 技术构建 rAAV 载体

目的基因以及ITR区域合成之后，构建AAV载体之后，再利用SmaI酶进行酶切后，验证条带大小。

图9: 酶切图，L1: undigested；L2: digested with SmaI andBsrGI；L3: ladder 5000，条带大小正确后，再利用sanger测序技术，测定目的基因和ITR区域序列：

图10：ITR区域测序图。

上图可以看出，Sanger测序验证了rAAV左右两侧的ITR区域序列正确。从而确保rAAV载体构建正确。

项目类型：Hi-Fi技术修复ITR序列

AAV原始质粒ITR缺失突变，常规PCR扩增很难直接完成序列修复，金唯智通过特定修复方案及Hi-Fi技术流程，成功交付多例修复质粒。

小贴士

1.以上服务仅用于科研，For Research Use Only；

2.ITR测序更多服务请点击：《金唯智新型技术测通AAV-ITR区域，解决基因治疗痛点》;

3.AAV载体构建服务请点击：《AAV载体构建莫发愁，金唯智Hi-Fi技术为你解忧！》。

References：

1.Kotterman M A, Schaffer D V. Engineering adeno-associated viruses for clinical gene therapy[J]. Nature Reviews Genetics, 2014, 15(7): 445-451.

2.Savy A. et al.,Impact of inverted terminal repeat integrity on rAAV8 production using thebaculovirus/Sf9 cells system. Hum. Gene Ther. Methods. 2017:28(5):277-289.

3.Wang et al, (2019). Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. https://doi.org/10.1038/s41573-019-0012-9

关于金唯智

GENEWIZ（金唯智）成立于1999年，总部位于美国新泽西州，是专注于基因组研究和基因技术应用的生物高科技公司。金唯智在全球范围内为科学研究人员提供高通量测序、Sanger测序、基因合成、引物合成、分子生物学服务及GLP标准规范服务。基于金唯智严谨的科学和卓越的服务，包括近30位诺贝尔奖获得者在内的众多科研工作者已成为金唯智的忠实客户，全球诸多知名跨国公司以及著名高等学府也把金唯智选为其战略合作伙伴和首选供应商。

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