肿瘤细胞可塑性和异质性在疾病进展及治疗中起着关键作用。例如，罕见的肿瘤细胞亚群可能是造成癌细胞耐药性及转移的潜在因素。目前，实验室培养的细胞系是癌症研究的主力军，但不清楚它们在多大程度上概括了肿瘤恶性细胞之间的异质性。随着测序技术的发展，单细胞RNA测序（scRNA-seq）已经成为研究肿瘤内异质性（ITH）的有效工具。

近日，来自以色列魏茨曼科学研究所的Itay Tirosh团队利用多重单细胞RNA-seq，分析了来自22种癌症类型的198个癌细胞系，确定了12个在多个癌细胞系中导致重复异质性的表达程序。此外，研究团队还建立了特定的肿瘤细胞异质性模型，可用于研究衰老相关细胞的亚群，以证明其动态性、调节性和独特的药物敏感性。该研究成果发表在Nature Genetics上，文章题为“Pan-cancer single-cell RNA-seq identifies recurring programs of cellular heterogeneity”。

文章发表在Nature Genetics上

研究团队开发了一种多路复用方法，利用10x Genomics Chromium系统对不同细胞系进行单细胞RNA-seq分析，基于基因表达和SNPs的细胞系分配对于98%的细胞是一致的（图1）。在去除低质量数据后，研究人员检测分析了来自198个细胞系的53513个细胞的表达谱，平均每个细胞检测19264个单分子标签（UMIs）和3802个基因，可反映22种癌症类型（图1）。

图1.多重scRNA-seq鉴定细胞系内表达的异质性及研究的癌症类型分布。来源：Nature Genetics

在单个细胞系的细胞间（包括离散的细胞亚群），研究团队发现了基因表达的广泛可变性，并利用t-SNE在11%的细胞系中发现了离散簇，表明离散亚群通常是细胞系特有的。通过识别每个细胞系中细胞状态的连续和离散可变性，在所有细胞系中检测到1445个表达程序，在单个细胞系中存在4~9个这样的程序。基于这些表达程序的共同基因，研究分析强调了相似程序的群集，称之为基因表达的重复异质程序（RHP）。最终，研究人员确定了12个RHP，其中两个最显著的RHP可反映细胞周期。细胞周期RHP对应于G1/S和G2/M期，并且在临床肿瘤样本中也可以观察到（图2）。

图2.体外及体内细胞周期的异质性模式。来源：Nature Genetics

结果显示，另外10个RHP反映了不同的生物学过程，且在很大程度上独立于细胞周期状态或被非周期细胞优先表达。研究人员通过对这10个RHP的标志基因、细胞系和潜在调节元件对这10个RHP进行了表征（图3）。

图3.10个RHP的功能注释。来源：Nature Genetics

研究发现了与多种类型应激反应有关的RHP。其中，RHP(8)反映了一种应激反应，包括DNA损伤诱导的和即刻早期基因（DDIT3、DDIT4和ATF3），类似于在黑色素瘤和HNSCC肿瘤中发现的程序；RHP(4)含有IFN响应基因（IFIT1-IFIT3），与卵巢癌中观察到的异质性程序非常相似。IFN响应可能是由基因组不稳定性通过cGAS-STING通路触发的；RHPs(9，10)分别由与蛋白质折叠和成熟以及蛋白酶体降解相关的基因组成。这也是唯一不同于任何体内异质性程序的RHP。

分析发现，与上皮-间充质转化(EMT)相关的RHP RHP(2)，即EMT-I，是黑色素瘤特异性的，并与另一个黑色素瘤特异性RHP(1)呈负相关。后者与皮肤色素沉着基因（MITF和PMEL）相关，在黑素瘤肿瘤中可观察到这两种黑色素瘤特异性RHPs及其负相关模式。RHP(3)，即EMT-II，包括vim，FN1等基因，主要可在HNSCC细胞系中观察到；RHP(5)，EMT-III在非周期细胞中包含了参与细胞连接组织的基因，如层粘连蛋白编码基因。EMT-I和EMT- II在特定的癌症类型中表达丰富，突出了EMT是一种常见的，因环境而异的细胞异质性模式，可能对转移和药物反应有重要的意义。

此外，与衰老程序相关的RHP(6，7)可优先在G0细胞中被观察到，反映了与细胞衰老有关的不同表达程序。RHPs 6程序包括衰老调节因子p21和其他p53靶基因；而RHP 7与低水平的增殖和分泌表型有关，与角质形成细胞、肺支气管细胞和其他上皮细胞的衰老反应非常相似，该程序缺乏经典的衰老标记物(p16和p21)，被称为上皮衰老相关（EpiSen）程序。

EpiSen程序是在衰老细胞中诱导的，但它的表达并不一定意味着完全的衰老表型。研究人员选择具有EpiSen和EMT-II RHPs高度变异的HNSCC细胞株作为特定模型进行进一步分析，分离出EpiSen-high 和EpiSen-low两个细胞亚群，其表达差异达12倍（图4）。结果表明，EpiSen程序具有动态可塑性，且与遗传亚克隆存在有限的关联。随后，研究人员比较了EpiSen-High和EpiSen-Low亚群对不同药物的敏感性，结果表明EpiSen-High细胞对PI(3)K和AKT的抑制剂以及通过PI(3)K-AKT轴传递信号的EGFR和IGF1R的抑制剂更敏感；EpiSen-low细胞对细胞周期调节因子（CDKs、CHK1和拓扑异构酶）的抑制剂更敏感。此外，EpiSen可用于预测临床药物反应，为了研究EpiSen在西妥昔单抗临床反应方面的潜在相关性，研究人员检查了40例复发或转移性HNSCC患者的大量预处理转录组数据，结果与体外观察一致，EpiSen丰度在PFS较长的患者中显著高于PFS较短的患者，其预测能力略高（图5）。

图4. EpiSen在三个亚群中的表达。来源：Nature Genetics

图5.HNSCC细胞系（体外）和肿瘤（体内）基因表达热图和ROC曲线。来源：Nature Genetics

综上所述，该研究利用单细胞RNA-seq技术描绘了198个细胞系的细胞多样性图谱，强调了在人类肿瘤中观察到的异质性程序的特定模型，对这些模型系统的进一步研究可提供对ITH的理解，有助于利用ITH开发新的治疗策略。

参考资料：

1. Kinker, G.S., Greenwald, A.C., Tal, R. et al. Pan-cancer single-cell RNA-seq identifies recurring programs of cellular heterogeneity. Nat Genet 52, 1208–1218 (2020). https://doi.org/10.1038/s41588-020-00726-6