基于组织检测的肿瘤突变负荷（tissue-based Tumor Mutational Burden, tTMB）是预测免疫检查点抑制剂（anti-PD-1/PD-L1）疗效的潜在生物标记物。近期，两项基于血液检测肿瘤突变负荷（blood-based Tumor Mutational Burden, bTMB）的研究亦得到了相似的结果，即bTMB能预测非小细胞肺癌（NSCLC）患者免疫治疗无进展生存期（PFS）的获益。但与tTMB不尽相同的是，在上述两项研究中，bTMB均未能预测免疫治疗总生存期的获益。考虑到总生存期是评估肿瘤临床获益的“金标准”，显著延长远期生存是免疫治疗的一大亮点与优势，故探寻bTMB与tTMB不同预测效能的潜在生物学机制，并进一步优化bTMB从而指导临床实践具有重要意义。

当地时间12月12日，由中国医学科学院肿瘤医院王洁教授团队与思路迪合作完成的最新bTMB学术成果在线发表于Journal of Thoracic Oncology期刊 （IF = 12.5)，论文题为：“Allele frequency-adjusted blood-based tumor mutational burden as a predictor of overall survival for non-small cell lung cancer patients treated with PD-1/PD-L1 inhibitors”。

该研究的核心创新点在于将患者的ctDNA含量（研究中以maximum somatic allele frequency-MSAF表示）纳入bTMB的算法模型中，首次提出了LAF-bTMB（low allele frequency-bTMB）的概念，并基于这一概念开发了新型算法。在此基础上，研究团队通过多个国内外临床队列验证了LAF-bTMB算法的预测效能，证明其确实优于当前国际主流算法；与此同时，研究结果还表明了LAF-bTMB-H与OS、PFS和ORR存在显著相关性，证明LAF-bTMB能有效预测患者的总生存获益。

首先，研究团队通过NCC队列、POPLAR及OAK三个队列，分析bTMB预测OS的效能；随后，在POPLAR和OAK两个队列中，进行bTMB算法的优化，提出LAF-bTMB的概念；最后在NCC队列中，验证LAF-bTMB和免疫治疗疗效的关系。

图1. 研究流程图。图片来源：Journal of Thoracic Oncology

研究团队对已发表的两篇bTMB文章的数据（Nature Med, 2018; JAMA Oncol, 2019）进行分析后发现，不管是NCC队列，抑或POPLAR&OAK队列，bTMB均无法区分免疫治疗OS获益人群。研究团队推测，这可能由于bTMB的检出需要依赖于血液中ctDNA的含量，如果ctDNA含量越高，bTMB的检出也越高。但是ctDNA含量越高，患者的肿瘤负荷相应也越高，预后更差，所以导致无法预测免疫治疗的长期OS获益。

后续结果验证了这一假设，研究团队在这三个队列中均观察到bTMB和ctDNA含量（MSAF代表）的正相关关系，同样，在bTMB高的人群中，ctDNA含量亦高，而ctDNA含量越高的患者，不管是免疫治疗或化疗，患者的总生存反而更差。这就形成了一个悖论：bTMB-H的患者理论上可能对免疫治疗更敏感，但同时因其ctDNA含量更高，故而预后更差，这一因素可能导致bTMB无法准确预测免疫治疗的疗效。这些结果提示，如果需要对免疫治疗疗效进行预测，计算bTMB时需要根据ctDNA的含量进行校正。

图2.在NCC和POPLAR及OKA两个队列中，bTMB均无法区分免疫治疗OS获益人群。图片来源：Journal of Thoracic Oncology

研究团队进一步发现bTMB的高低确实与ctDNA的含量有着正相关关系，但是这种正相关关系通常发生在丰度较高的突变中。基于此，研究团队将bTMB分成两个部分，一部分是由低丰度的突变组成（low-allele frequency bTMB, LAF-bTMB），另一部分是由高丰度突变组成（high-allele frequency bTMB, HAF-bTMB）。结果显示，低丰度的突变数量并不随着ctDNA的含量而发生变化，而高丰度的突变数量会随着ctDNA的含量而变化，而这一差异在突变丰度的阈值为5%时最为明显。 

图3. bTMB和ctDNA含量（MSAF代表）有正相关关系，且正相关关系通常发生在丰度较高的突变中。图片来源：Journal of Thoracic Oncology

基于以上发现，研究团队将突变丰度≤5%的突变数量定义为LAF-bTMB，而>5%的突变数量定义为HAF-bTMB（计算的方法如下图所示）。

图4. 计算LAF-bTMB的模拟示意图。图片来源：Journal of Thoracic Oncology

随后，研究团队在POPLAR及OAK队列中发现，HAF-bTMB越高，患者的预后越差，这提示LAF-bTMB可能作为免疫治疗的biomarker。研究团队紧接着利用POPLAR和OAK队列进行了LAF-bTMB cutoff值的确定及验证。在POPLAR队列中，当LAF-bTMB≥12时，免疫治疗组的OS显著优于化疗组，而LAF-bTMB＜12时，免疫治疗组的OS与化疗组无差异（P interaction = 0.04）；同样的结果也在OAK队列中得到了验证。

图5. 在POPLAR和OAK队列中，LAF-bTMB可以预测患者免疫治疗OS获益。图片来源：Journal of Thoracic Oncology

基于POPLAR及OAK研究的设计及生存数据的高度一致性，研究团队将两项研究进行了合并以分析LAF-bTMB的可靠性。结果显示，LAF-bTMB能很好地预测免疫治疗的OS（P interaction = 0.006）及PFS（P interaction＜0.001）。

图6. POPLAR及OAK研究合并分析的结果显示LAF-bTMB能预测免疫治疗的PFS和OS获益。图片来源：Journal of Thoracic Oncology

研究团队进一步比较了LAF-bTMB与传统bTMB在预测疗效上的差别。两个研究合并共有106名患者用此两种不同的bTMB预测疗效。研究团队发现，在传统bTMB低、但LAF-bTMB高的患者人群中，接受免疫治疗的OS要优于化疗；但在传统bTMB高、LAF-bTMB低的人群中，接受免疫治疗的OS和化疗无差异。这样的结果提示，LAF-bTMB能够比传统的bTMB更准确地识别免疫治疗获益的人群。

图7. LAF-bTMB比传统的bTMB更能识别免疫治疗获益的人群。图片来源：Journal of Thoracic Oncology

最后，研究团队利用中国NCC队列（n=64）进一步验证了LAF-bTMB对免疫治疗OS的预测意义。虽然NCC队列和POPLAR&OAK队列中所使用的免疫药物和panel存在不同，但是在NCC队列中，研究团队观察到了同样的现象，即LAF-bTMB的数量检出不依赖于ctDNA的含量，在LAF-bTMB的cut-off值为7时，LAF-bTMB高的患者免疫治疗的OS，PFS，ORR均优于LAF-bTMB低的患者。

图8. 中国NCC队列（n=64）进一步验证了LAF-bTMB对免疫治疗OS的预测意义。图片来源：Journal of Thoracic Oncology

本项研究首次揭示了影响bTMB预测效能的潜在因素——ctDNA含量，并通过重新定义的LAF-bTMB解决了上述问题。POPLAR、OAK及中国人群的独立验证队列均显示LAF-bTMB能有效预测免疫治疗的OS及PFS。本项研究为探寻bTMB预测效能的潜在生物学机制指明了方向，对进一步优化bTMB从而指导临床实践具有重要意义。

中国医学科学院肿瘤医院王洁教授为该研究论文的通讯作者，王志杰教授、段建春教授以及思路迪公司王国强博士为论文共同第一作者。