肝细胞癌（HCC）是一种常见的原发性肝癌。肝癌各期的5年生存率仅为15%，但如果早期诊断，生存率可达70%。因此，HCC的诊断和预后迫切需要可靠的无创生物标志物。除去人们熟知的ctDNA等，在HCC患者与健康个体中，很多细胞外RNA（exRNA）之间也存在差异，但大多数缺乏独立验证和深入研究，还无法作为HCC生物标志物应用于临床。
近日，清华大学生命学院鲁志研究团队、天津医科大学肿瘤医院张倜研究团队和第二军医大学殷建华研究团队在国际主流临床实验杂志Clinical Chemistry联合发表了有关体液RNA的最新研究成果。该研究发现，除miRNA外，血浆中的多种非编码RNA（ncRNA）及其结构域也可以作为HCC诊断和预后的无创生物标志物。尤为重要的，该研究在HCC病人血浆中鉴定了一种srpRNA（RN7SL1）的稳定结构域。该段结构域在血浆中因为二级结构和蛋白结合等原因而稳定存在，并在区分HCC、慢性乙型肝炎患者和健康人群时具有良好的敏感性和特异性，在HCC诊断和预后方面具有可靠的临床表现。
对于细胞外RNA（exRNA），很多时候也称为体液RNA（cfRNA）。目前的研究大多局限在miRNA等小RNA上，对体液中的其他ncRNA成分和标志物效用研究不多，尤其是对于体液中稳定存在的RNA结构更是知之甚少。为了揭示体液中多种多样的ncRNA及其结构域在HCC无创生物标志物的潜能，鲁志研究团队对来自血浆和外泌体的RNA进行了测序，全面分析其转录组，并研究了多种类型ncRNA及其结构域作为HCC生物标志物的潜力。
在鉴定研究阶段，研究人员共对45个血浆cfRNA文库进行了测序，包含31个HCC样本、11个健康混合样本（多个健康人）、3个疾病混合样本（多个乙肝和肝硬化病人）。同时，还对4个外泌体RNA（exoRNA）进行了测序，包含2个HCC混合样本和2个健康混合样本。
图1. 体液中cfRNA和exoRNA（小RNA测序）的测序特征。A：RNA种类在血浆、外泌体和组织中的分布比例。B：（左）HCC血浆中测到的各种ncRNA的基因个数（多样性）；（右）HCC血浆中测到的各种ncRNA的丰度。
研究发现，体液中稳定存在一些ncRNA，因为二级结构、RNA结合蛋白保护等原因能够逃避RNA酶的降解；同时，有近900个ncRNA在HCC患者中高度上调。这些RNA中，除了过去通常研究的miRNA，很多片段化的lncRNA，snoRNA，srpRNA等的数目更多。研究人员选择了48个ncRNA进行RT-qPCR验证，其中16个ncRNA被证实在HCC中显著上调，包括RN7SL1（一种srpRNA）、SNHG1、ZFAS1和LINC01359。此外，RN7SL1 S片段可单独促进癌细胞增殖和克隆生长。具有较高浓度RN7SL1 S片段的HCC患者具有较低的存活率。该片段的结构域在血浆和外泌体中稳定存在，在区分HCC、慢性乙型肝炎患者和健康人群时具有良好的敏感性和特异性，有良好的临床应用前景。
图2. 一种非编码RNA（srpRNA：RN7SL1）的结构性片段在HCC血浆中稳定存在并显著上调，RN7SL1之前在乳腺癌中的研究表明其在细胞外的功能和肿瘤微环境相关，该片段在体液中稳定存在的可能原因包括稳定的二级结构和蛋白质结合保护等。
在癌症研究中，生物标志物具有诊断、预后和预测价值，其敏感性和特异性在临床精准医疗中尤为重要。多种多样、数目繁多的ncRNA作为生物标志物有很大的临床应用潜力，但将其用于临床疾病诊断和预后仍存在很大的阻碍。例如，目前还没有建立相关的样本采集、文库构建、数据规范化分析的标准。此外，为提高cfRNA作为临床预后生物标志物的稳健性，需要收集具有足够临床信息的血浆数据，在确保准确性的基础上，进行大量临床样本的验证。希望随着后续研究工作的推进，鲁志研究团队与合作者能够带给我们更多惊喜，让我们拭目以待。
清华大学生命科学学院鲁志研究员、天津医科大学肿瘤医院张倜医师以及第二军医大学殷建华博士为文章通讯作者。清华大学生命科学学院博士生谈畅、曹静怡以及天津医科大学肿瘤医院陈璐博士为文章第一作者。此外在实验过程中得到了清华大学医学院王栋课题组的协助。本项研究受到了国家自然科学基金委、国家重点研发计划、霍英东教育基金会以及北京结构生物学高精尖中心的资助。
鲁志实验室介绍
清华大学生命学院鲁志实验室致力于发展生物信息学技术，并探索能够广泛应用于基因组学和癌症生物学的医学实践。实验室利用高通量测序，结合机器学习和人工智能技术，来研究遗传信息是如何被编码在结构化的DNA和RNA分子之中，以及它们是如何在一个生命体系中相互作用、彼此调控。实验室欢迎各界人士进行相关领域的深度合作，为癌症早期筛查、早期诊断以及预后治疗寻找到更好（精准、重复性高、经济上利于普及大众、操作上简单无创）的新型体液标志物，并标准化其检测和解析流程，开发出新的液体活检技术（https://lulab.github.io/exRNA/recruit/）。
参考资料：
1. Chang Tan1, Jingyi Cao1, Lu Chen1, Xiaochen Xi, Siqi Wang, Yumin Zhu, Liuqing Yang, Longteng Ma, Dong Wang, Jianhua Yin*, Ti Zhang* and Zhi John Lu* (2019) Noncoding RNAs serve as diagnosis and prognosis biomarkers for hepatocellular carcinoma Clinical Chemistry 65:7 (1contributed equally, *co-corresponding)
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