精准医疗使医疗技术获得了飞跃式的发展进步，多项研究成果表明，基于CRISPR/Cas9的基因疗法在遗传病治疗中有很大的应用前景。2017年，Spark公司的创新基因疗法Luxturna获得美国FDA批准上市，用于治疗患有特定遗传性眼疾的成人和儿童患者，为基因疗法研究注入了一剂强心剂。

2月18日，《自然医学》杂志同期发表了三篇基因疗法相关文章，展示了基于CRISPR/Cas9的基因疗法治疗罕见遗传病的突破性研究成果。

在杜氏肌营养不良（DMD）基因治疗长期疗效及安全性研究中，杜克大学的研究人员已经证明，基于CRISPR的基因疗法可以在一年的时间里，安全、稳定地纠正小鼠体内的DMD。研究中也观察到了免疫反应和脱靶效应，但目前的研究结果显示该疗法是安全有效的，后续仍需进行仔细地监测验证研究。接下来，我们重点了解一下这项研究。

该研究由杜克大学Charles Gersbach教授领导完成，其研究团队自2009年起就致力于DMD的基因疗法研究开发。DMD由抗肌萎缩蛋白（Dystrophin）的编码基因突变导致。如果编码抗肌萎缩蛋白的一个或多个外显子发生突变，机体就无法产生抗肌萎缩蛋白，进而导致肌肉缓慢地断裂和退化。基于该机制，Gersbach教授研究团队开发了一种基于CRISPR的基因疗法（AAV为载体）。该疗法是利用CRISPR/Cas9切断抗肌萎缩蛋白外显子周围发生突变的基因，再利用人体的自然DNA修复系统将剩下的基因重新“缝合”在一起，从而产生一个缩短的、具有正常功能的抗肌萎缩蛋白编码基因。

在动物模型试验中，研究团队选用了成年和新出生的DMD小鼠模型。研究人员为DMD小鼠模型实施了单剂量静脉注射的上述基因疗法，并进行了追踪。前8周研究结果显示，小鼠的抗肌萎缩蛋白功能得到恢复，肌肉力量增强，表明该基因疗法确实有效。

此前的DMD治疗研究都集中于抗肌萎缩蛋白的短期恢复，通常在治疗后4-8周进行评估。然而，基因编辑会导致永久性的基因改变，所以探索该基因疗法可能带来其他后果，以及疗效的持久性至关重要。在接下来的一年中，研究人员对注入小鼠体内的CRISPR系统编辑效果进行了检测跟踪。令人惊喜的是，研究结果表明，该疗法不仅成功编辑了小鼠体内的缺陷基因，并使其获得了长期表达抗肌萎缩蛋白的能力，所有的老鼠在治疗一年后都表现良好！

除了疗效，基因编辑的脱靶问题也非常惹人关注。为了全面研究该基因疗法产生的所有基因编辑事件，研究团队采用了一种DNA测序方法，该方法可报告任何基因编辑类型。研究发现，除了预期的目标外显子外，还有许多种其他编辑类型，包括来自CRISPR/Cas9系统病毒载体的高水平DNA序列插入。

经过对组织类型和CRISPR输送剂量进行分析，研究人员发现，多达一半的基因编辑会导致这些脱靶效应。虽然该结果令人惊讶，但目前的研究数据显示，这些非预期的DNA序列变化并不会影响该基因疗法对DMD的治疗效果和安全性。虽然如此，研究人员表示，任何非预期的基因编辑结果都有潜在的价值，这些基因编辑事件在未来研究的方法设计、识别和减少脱靶效应中都有重要作用。

图：未治疗DMD小鼠模型（左）和使用该基因疗法治疗一年后的DMD小鼠模型（右）。绿色表示抗肌萎缩蛋白基因表达水平较高，黑斑表示来自小鼠的T细胞响应细菌Cas9蛋白，表明存在免疫反应。

此外，已有研究表明小鼠的免疫系统可对Cas9产生反应，这可能干扰CRISPR的编辑效果。为此，研究团队还监测了小鼠模型对Cas9蛋白产生的所有免疫反应。研究人员在成年小鼠模型中观察到了抗体和T细胞对Cas9的反应，但这些免疫反应似乎都没有在小鼠体内产生任何毒性，且没有影响治疗效果；新出生的小鼠模型则没有类似的免疫反应。同时，研究人员也在开发新的策略来限制Cas9的表达或在短时间内仅将CRISPR/Cas9系统输送到肌肉细胞，以减少可能的免疫反应。

与该研究同期发表的还有另外两篇文章，都是针对早衰综合征（HGPS）的基因治疗展开，文章题目分别为“Development of a CRISPR/Cas9-based therapy for Hutchinson–Gilford progeria syndrome”和“Single-dose CRISPR–Cas9 therapy extends lifespan of mice with Hutchinson–Gilford progeria syndrome”。前一项研究由西班牙和英国科学家合作完成，后一项由美国索尔克生物研究所科学家领导完成。

HGPS是由LMNA基因点突变引起的一种罕见致死性遗传病。该病的患者自童年开始就快速地衰老，目前还没有针对HGPS的有效治疗。已有研究发现，Lamin A蛋白的编码基因LMNA的突变，促使机体产生了孕激素有毒异构体，这是HGPS的主要致病原因。

在西班牙科学家领导的研究中，研究人员探讨了一种基于CRISPR/Cas9基因疗法的有效性，该方法通过在LMNA基因中引入移码突变，阻断Lamin A蛋白和孕激素的积累，来恢复HGPS引起的细胞成分的变化。研究结果显示，该基因疗法可广泛地改善HGPS小鼠的表型，并延长寿命。

在由美国科学家领导的最新研究中，研究人员通过单剂量全身性注射AAV病毒介导的CRISPR/Cas9组分，来降低小鼠模型中的Lamin A蛋白/孕激素水平，以抑制HGPS的发生。研究结果显示，该基因疗法改善了HGPS小鼠的健康状况，并延长了小鼠的寿命。以上两项研究均展示了CRISPR/Cas9在HGPS小鼠模型中的治疗效果，也为在其他目前无法治愈的罕见疾病中使用CRISPR/Cas9开辟了道路。

基因疗法已经引起了各国科学家和跨国制药巨头的关注。2018年12月1日，美国FDA已经接受Editas Medicine公司为EDIT-101递交的IND申请，允许该公司开展使用CRISPR基因编辑手段治疗Leber先天性黑朦10型患者（LCA10）的临床试验。EDIT-101有望成为世界上第一款在人体内使用的CRISPR疗法。此外，还有多项针对艾滋病、血友病、地中海贫血、心血管病、肾病、肺病等疾病的基因疗法研究正在进行，部分已进入临床试验阶段。希望随着科学技术的进步，更多安全有效的基因疗法能够开发出来，为推进科学和人类健康进步贡献力量。

参考资料：

1. Long-term evaluation of AAV-CRISPR genome editing for Duchenne muscular dystrophy

2. Single CRISPR treatment provides long-term benefits in mice

3. Development of a CRISPR/Cas9-based therapy for Hutchinson–Gilford progeria syndrome

4. Single-dose CRISPR–Cas9 therapy extends lifespan of mice with Hutchinson–Gilford progeria syndrome