2017年7月5日，Nature发布单细胞生物学特刊，将视线聚焦于生命的最基本单位：细胞。特刊表示，当前生命科学领域已经逐渐步入单细胞生物学时代，单细胞测序技术的进步使我们能够在单细胞层面绘制复杂机体的细胞图谱，探索机体细胞的类型、它们的作用及发展过程。此前，测序中国曾发步了单细胞生物学专题报道。点击链接，即可查看相关内容

图1. 人类细胞图谱计划

2016年，人类细胞图谱计划（Human Cell Atlas Project）被提出：根据独特的分子信息（如基因表达）对所有人类细胞种类进行定义，并将这些信息与传统的细胞学表述（如位置和形态）相关联，来了解人体中的所有细胞的类型、每个细胞的空间位置、每个细胞在不同生命时刻的状态以及不同个体细胞图谱的叠加，并根据不同健康状态、基因型、生活方式和外界环境加以注释。

图2. 单细胞测序技术应用的技术路线

而传统的单细胞测序技术只是对单个细胞进行转录组学的研究，很难实现大通量单细胞转录组测序；近年来，单细胞测序技术获得快速发展，尤其是基于微液滴技术的大规模单细胞分选平台的出现，使我们能够以较低的成本对某一器官或者组织构建其细胞表达图谱，了解各个器官或者组织细胞复杂的基因网络在单个细胞中的运作机制，并了解各个细胞中这些网络的差异，以及最终各种细胞群体如何协同工作。

图3. 大规模单细胞测序技术构建人类细胞图谱

2016年2月，10X Genomics公司推出大规模单细胞转录组测序系统——Chromium™ Single Cell 3' Solution，可以对高通量的数字基因表达的复杂细胞群进行深入分析，引领生命科学研究进入单细胞生物学时代。

作为国内第一家引进10X Genomics平台的公司，博奥晶典率先推出了Chromium™ Single Cell 3' Solution平台服务，并完成了人和小鼠的肝脏、肺脏、皮肤、心脏、脑、肾脏、血液，以及植物叶片等多种类型样本的检测。

一、产品简介

Chromium™ Single Cell 3' Solution是一种在单个细胞水平对mRNA进行高通量测序的新技术，为单细胞转录组研究提供更具扩展性的平台。其基于10X Genomics平台，一次性能够分离500~10000个单细胞，并能够将分离的单个细胞中的微量mRNA通过高效扩增后再进行高通量测序，有效地解决了组织样本无法破解的细胞异质性难题，有助于发现新的细胞类型；并基于大量的单细胞基因表达数据，可进行细胞表达特征聚类、亚群表达特征、标志物筛选等方面的分析，是一种高效的细胞基因表达水平的检测技术，在生殖、免疫反应、干细胞发育与分化、肿瘤异质性、神经系统研究以及脑发育等研究领域中有着广泛的应用。

图4. Chromium™ Single Cell 3' Solution平台

1. 基本技术原理

Chromium™ Single Cell 3' Solution是建立在 GemCode技术上的微流体平台，将带有条形码和引物的凝胶珠与单个细胞包裹在油滴中；接下来在每个油滴内，凝胶珠溶解，细胞裂解释放mRNA，通过逆转录产生用于测序的带条形码的cDNA；液体油层破坏后，cDNA后续进行文库构建，然后使用Illumina测序平台对文库进行测序检测，即可一次性获得大量单细胞的基因表达数据，从而实现在单细胞水平进行表达测序的目的。

图5. Chromium™ Single Cell 3' Solution技术原理

2. 实验流程

将样本制成单细胞悬浮液，用Countess® II Automated Cell Counter或者Countstar 进行细胞计数和细胞活性测定，然后将细胞浓度调整到理想浓度1000个/μL；利用10X Genomics平台标记cDNA，从而完成单细胞转录组文库的构建；进一步用Illumina HiSeq平台或者NextSeq平台进行测序，获得每个细胞的基因表达数据；基于单细胞基因表达数据进行细胞表达特征聚类、亚群表达特征、标志物筛选等方面的分析。

图6. Chromium™ Single Cell 3' Solution实验流程

3. 样本要求

• 样品类型：新鲜细胞悬液、血液（全血、PBMC等）、培养细胞瓶（皿）、植物原生质体、 冻存细胞悬液。
• 质量要求：细胞活性大于90%，浓度为500~2000cell/μl，体积大于200微升，不含有Ca²⁺和Mg²⁺。
• 保存运输：新鲜样品冰块保存、新鲜运输；冻存样品干冰运输。

二、产品优势

1. 细胞选取灵活：每个样本细胞数可达500-80, 000个，细胞数量可以灵活选取；

2. 项目周期短：10min内实现对上万个细胞的封装，1天内即可完成细胞悬液制备、单细胞捕获、扩增及建库，且可同时获得上万个细胞的分析结果，大大缩短项目周期；

3. 细胞捕获效率高：单个细胞捕获率高达65%，高效获取每个细胞中的基因表达；

4. 真正大规模单细胞测序：单个液滴捕获到多个细胞的概率极低，0.9%/1000cells，分析上通过严格质控，利用barcode信息及UMI去除含多个细胞数据，实现真正意义上的单细胞测序；

5. 低成本：相较于其他单细胞平台，如Fluidigm C1平台、已推的Illumina Bio-Rad Single Cell Solution平台或传统手工扩增方法等，价格大幅优惠；

6. 应用范围广：对细胞类型无限制，已成功应用于识别细胞周期、肿瘤细胞异质性研究、鉴定罕见细胞类型、免疫细胞分型、疾病分型等领域；

7. 高性价比：与传统手工细胞分离测序方法相比，价格优惠数十倍；

8. 丰富的项目经验：目前完成了人和小鼠的肝脏、肺脏、皮肤、心脏、脑、肾脏以及植物叶片等样本类型的检测。

三、不同大规模单细胞平台间的比较

相比于其他大规模单细胞分选平台，Chromium™ Single Cell 3' Solution在通量、成本以及周期等方面具有明显的平台优势。

表1. 大规模单细胞分选平台之间的比较

四、已发表相关的文章

Chromium™ Single Cell 3' Solution平台已经发表8篇高水平文章（Nature、Cell、Nature Methods等），总影响因子达到167.467，已经广泛应用于方法学研究、细胞发育、免疫反应、干细胞分化等研究领域。

表2. Chromium™ Single Cell 3' Solution平台已经发表的相关文章 

五、应用方向

1. 应用领域一：人类细胞图谱构建

人体由数万亿细胞构成，细胞是生命的基本单位，是理解健康和疾病生物学的关键，但目前我们对细胞在每个器官之间的差异的理解非常有限，甚至不知道在体内有多少不同类型的细胞。人类细胞图谱构建是理解细胞新时代的开始，将有助于发现新的细胞类型，发现细胞在发育和疾病期间如何随时间变化，从而获得对生物学的更好理解。

利用Chromium™ Single Cell 3' Solution平台，研究人员可以对人体各种细胞进行测序，获得人体单细胞的转录组图谱，并基于基因表达将细胞分类，定义新的细胞，绘制所有细胞及其分子的空间组织方式，探索人体各个器官细胞复杂的基因网络在单个细胞中的运作机制，并了解各个细胞中这些网络的差异，以及各种细胞群体最终如何协同工作。

2. 应用领域二：肿瘤异质性研究

肿瘤的异质性是恶性肿瘤的特征之一，在肿瘤的生长过程中，经过多次分裂增殖，其子细胞呈现出分子生物学或基因方面的改变，从而使肿瘤的生长速度、侵袭能力、对药物的敏感性、预后等各方面产生差异。

利用Chromium™ Single Cell 3' Solution平台，可为肿瘤研究人员提供大量基因表达信息，来进行肿瘤细胞异质性研究、肿瘤细胞分群以及新类型细胞的发现，进一步研究肿瘤细胞克隆进化机制及相关新生物标记的鉴定等，将会有助于肿瘤的精准治疗。

3. 应用领域三：干细胞发育以及分化

干细胞能够分化成为机体内任何类型的细胞，既是研究人体早期发育的理想工具，也是细胞治疗的宝贵资源，在医学领域有非常广泛的应用。而细胞间差异和异质性是干细胞群体固有的基本特性，如果我们对一群细胞进行组学分析，这些关键的信息就会被掩盖。

利用Chromium™ Single Cell 3' Solution平台，可以对同种干细胞进行全面剖析细胞异质性，鉴定不同表型的细胞，寻找不同类型干细胞的特异性标记（marker），解析干细胞发育和分化的分子机理。

4. 应用领域四：免疫反应研究

免疫反应是指机体对于异己成分或者变异的自体成分做出的防御反应，传统的检测方法，取样来自一大堆细胞，低估了单个免疫细胞的多样性。并且，肿瘤的发育和免疫系统功能的失调有着密切的关系，细胞间广泛存在的细胞异质性则使研究更加复杂化。

利用Chromium™ Single Cell 3' Solution平台，分析免疫细胞遗传物质的多样性以及病原体导致免疫细胞的高度异质性，从而理解机体复杂的免疫机制；并且可以鉴定稀有的免疫细胞类型，发现新的分子标记，便于更深层次地挖掘免疫细胞以及研究免疫反应的分子机理。

5. 应用领域五：神经系统发育研究

神经元表达的基因多于其它类型的细胞，导致了神经元具有很高的异质性。单个神经元细胞产生，轴突和树突的发育，功能相关的神经细胞相连引起的突触形成，突触在基因和环境的多因素作用下的成熟过程，成熟神经的突触介导的突触可塑性改变，神经损伤和疾病状况下突触功能的减弱和缺失等。

利用Chromium™ Single Cell 3' Solution平台，研究不同的神经元细胞的异质性以及神经元细胞的细胞分群情况，进一步神经元细胞是如何从神经干细胞分化产生分子调控机制，将会有助于我们了解疾病发生、发展的机制。

6. 应用领域六：脑发育研究

人脑是由多种不同类别细胞组成的极其复杂的器官，由数百种不同类型的上千亿的神经细胞所构成的极为复杂的生物组织。传统的细胞分类方法只能根据少数已知的细胞的标记分子（marker）对细胞进行分类，对每一类细胞的认识也非常有限。

利用Chromium™ Single Cell 3' Solution平台，可以获得人脑细胞基因表达的图谱，解析人脑细胞的异质性，获得人脑细胞的复杂的细胞类群，可以帮助我们更好地理解人脑正常功能及异常。