第三代测序技术，即单分子测序技术，又称纳米孔测序，以美国太平洋生物（Pacific Biosciences）的SMRT技术为代表。DNA测序时，不需要经过PCR扩增，实现对每一条DNA分子的单独测序。

SMRT测序面临的一个挑战是将更长的DNA分子放入100纳米大小的零模波导孔（ZMW）。目前，DNA模板必须通过生物亲和素固定到ZMW上，DNA分子会以自己的方式扩散到ZMW，而这个过程更利于短DNA片段。多年来，PacBio公司一直在改进工艺，但所需DNA样本量仍然高于纳克水平。

近日，PacBio公司和美国东北大学的研究人员证明，纳米孔与PacBio测序系统结合的技术经改造后，可以优先加载长DNA分子，并且减少所需DNA样本量。

9月11日，该研究发表在Nature Nanotechnology（IF：38.986），这是由美国国家人类基因组研究所资助的一项为期3年的研究项目成果之一。

该研究小组2014年公布了这项工作的第一个成果，成功构建了混合纳米孔和ZMW的配置，DNA可以通过这个结构载入测序系统。现在，研究人员证明该方法是可行的，长DNA分子也可以测序并读出，更重要的是，所需DNA样本量少于通常PacBio测序所需样本量。

美国东北大学物理学副教授、该研究的资深作者Meni Wanunu表示：“这仍然是一个概念证明”。研究团队与PacBio公司合作的目标是找出一种方法减少系统所需DNA样本量并优先加载较长DNA分子。

如何达到这样的目的呢？

Wanunu团队的办法是在每个ZMW底部设置纳米孔制成NZMWs，并施加电压驱动DNA通过纳米孔。Wanunu说，这样的结构能够大量加载DNA并优先加载更长的DNA片段。

研究小组利用六个NZMWs进行试验，研究了从1kb到48.5kb的DNA片段如何被NZMWs 捕获。团队证明，10皮克的DNA样本可以在不到一分钟的时间加载完成。而传统方法加载10kb的SMRTbell样品需要输入1.5微克的DNA，要花费1小时。

传统PacBio测序，DNA模板是与DNA聚合酶链亲和素融合蛋白结合在一起，然后蛋白结合波导上的生物素基团，进行测序。研究小组证明可以在NZMWs构建类似DNA聚合酶链复合物捕获DNA，进行测序。

NZMW与ZMW相比有什么优势？

研究人员比较了NZMW与ZMW测序情况。添加模板DNA与荧光标记的核苷酸，测试了72个基本的环状DNA和DNA聚合酶模板。研究人员使用电压脉冲将聚合酶激活，进行荧光测序，发现荧光光阵只出现在NZMWs，也就是说在短短的3秒加载时间内，DNA模板就被加载到NZMWs，而没有DNA被加载到ZMWs。

最后，研究人员展示了一个已知的20kb SMRTbell序列的测序。他们用不到1纳克的DNA样本，施加2秒电压脉冲，就将DNA加载到了NZMW。

Wanunu说，团队下一步将继续优化设计包括放大 NZMW 设计，为每个ZMW纳米孔构建晶片，使每个 NZMW 不需要单独制作。

此外，Wanunu团队也与PacBio合作开发直接RNA测序技术。Wanunu表示，计划把研究重点放在用NZMW装置进行直接RNA测序，“一旦达到DNA和RNA的高质量测序目的，我们就可以与PacBio的仪器一体化，这之前，我们还有一段路要走。”

PacBio的首席科学官Jonas Korlach，拒绝讨论该公司是否计划将nanopore ZMWs（NZMWs）作为其商业平台的技术优化方向。他声明，在Nature Nanotechnology发表的研究不以任何方式反映任何有关当前或未来SMRT测序平台商业实现或特点的预测。

参考资料：

Length-independent DNA packing into nanopore zero-mode waveguides for low-input DNA sequencing