几乎所有看似无限复杂的生物学都发生在三维空间中。在生物体内，细胞必须在三维组织中相互作用和组合，每个细胞的位置与其固有性质一样重要，决定着组织的功能或疾病的功能障碍。因此，即使在研究简单生物体或单个组织的结构时，不仅需要破译成千上万个细胞的分子谱，还需要了解空间环境如何以及造成怎样的影响。近年来，随着多重空间分子检测技术的创新爆发，生物学研究开辟了新的篇章，使人们能够进一步了解生命系统的复杂性。
空间组学是继单细胞测序技术之后的又一个生物技术研究热点，其能够弥补单细胞测序技术无法获取细胞空间分布信息的缺陷。空间组学技术主要研究细胞在组织样品中的相对位置关系，用于揭示细胞空间分布关系对疾病的影响，主要检测蛋白质及其修饰或mRNA。虽然空间组学技术存在成本高、耗时长等局限，但目前这一新兴技术已为多个领域提供了大量新见解，包括动物发育和大脑结构以及与患者预后相关的肿瘤微环境（TME）的特征。
近日，英国癌症研究中心（CRUK）剑桥研究所的研究团队在Science上发表了综述文章“The dawn of spatial omics”，系统地介绍了空间组学技术的丰富种类，阐明了其原理、优势和局限性，并就这一领域目前面临的挑战提供了观点和建议。
文章发表在Science
质谱流式细胞术
在过去20年间，通过免疫组织化学（IHC）和原位杂交（ISH）技术，人们已经能够对组织进行原位检测。近年来，科研人员开发了“质谱流式细胞术（MC）”（图1），其将流式细胞技术与质谱分析技术结合在一起，使用稳定的重金属同位素（主要是镧系元素）代替荧光基团来标记抗体，并利用质谱来定量同位素标签。
MC技术可在单细胞水平同时对50种参数进行分析，包括蛋白质、核酸和小分子等，信噪比（SNR）非常高，但其目前受到足够纯金属可用性的限制。此外，该方法也是两种空间成像技术的基础，即成像质谱细胞术（IMC）和多重离子束成像（MIBI）。
图1.基于多重抗体检测的空间蛋白质组学方法。
基于激光显微切割的转录组学
显微切割技术是指通过物理分离从特定区域纯化生物分子，即对欲选取的材料（组织，细胞群，细胞等）进行切割分离并收集用于后续研究的技术，是为分子谱分析添加空间信息的简易方法，也是空间转录组学（ST）的重要技术。显微切割能够提供非常深入的分析，几乎可达到批量测序水平，并允许科研人员将目标区域从单个细胞扩展到整个区域，但其通量相对较低。
目前，应用最广泛的显微切割技术是激光捕获显微切割（LCM）。LCM通常用于分离小区域（数十到数百个细胞）以进行RNA测序（RNA-seq），并且可以达到单细胞分辨率。LCM的优势包括广泛的转录谱、精确的组织切片以及能够与FFPE组织兼容，但难以扩展到更大数量的样本，并存在潜在的RNA降解问题。
图2. 空间选择和剖析方法。
基于图像的原位转录组学
单分子荧光原位杂交（smFISH）可以同时检测多个RNA，被认为是RNA定量方法中的“金标准”。smFISH可以检测到低丰度的转录本，由此衍生的空间分析技术往往具有优异的灵敏度。循环杂交方法（osmFISH、seqFISH）是smFISH的衍生方法（图3），这是一种将组织中的单个mRNA分子分解为亚衍射荧光点的技术。为实现检测，循环杂交需要将多个探针与相同的mRNA分子进行结合，或是需要多个荧光团结合到一个小区域以产生信号，或是两个探针在几个核苷酸距离内同时结合以触发信号扩增过程。
多重容错性荧光原位杂交（MERFISH）和seqFISH+技术是目前两种主要的基于杂交的原位转录组学方法。两种方法通过结合寡聚抗体同时检测mRNA和蛋白质，可达到全转录组水平，并成功应用于不同器官和组织的空间基因表达研究。两者在灵敏度、通量和优缺点方面非常相似，但在流程操等方面存在一些技术差异。
图3. 基于图像的空间转录组学方法。
基于空间条形码的转录组学
与基于图像的原位转录组技术不同，基于空间条形码（Spatial barcoding）的方法允许在整个转录组水平上对有 RNA 的物种进行无偏倚测序。空间条形码技术是通过使用空间条形码寡核苷酸阵列捕获组织RNA，将RNA序列及其空间位置关联起来（图4）。具体而言，在空间转录组学中，使用微阵列技术将有序的寡核苷酸阵列沉积在玻璃载玻片上；然后将薄的组织学切片放置在阵列上，通过渗透使细胞RNA扩散到条形码寡核苷酸；并在原位逆转录以产生空间索引的cDNA，然后将后者扩增产生文库并进行测序。
空间条形码技术的关键优势是能够产生长测序reads，不依赖于复杂的成像仪器，具有高速度以及并行化的潜力，极大地促进了商业应用。目前，空间条形码技术与批量测序相结合非常成功，但该技术仍存在一些不足，包括低分辨率（目前为50-100μm）、每个样品的成本高以及RNA捕获效率低。
图4. 空间条形码方法。
空间组学技术面临的挑战
数据采集通常被认为是空间组学方法中最困难的步骤，此外数据操作、分析和可视化同样重要。其中，图像配准是一个非常重要的问题，巨大的数据量使空间分析变得更加复杂。目前，大多数图像配准方法采用易于识别的“基准地标”（荧光珠）作为特征来计算配准矩阵（图5），这使得配准更容易，但代价是需要额外的实验处理。
此外，大多数转录组学方法需要解码步骤，这些处理流程需要量身定制，以考虑每种技术或显微镜特有的扭曲和畸变，因此很难标准化和优化。
图5. 空间剖面数据集的分析工作流程。
展 望
空间组学领域未来的发展趋势主要体现在三个方面：1）多组学，即同时检测不同的参数（如 DNA、RNA 和蛋白质）；2）增加获取和普及性，使技术变得更容易获得、更可靠、更强大；3）改进分析框架。随着技术的不断发展，需要对数据分析和实验设计给予更多关注。空间组学技术已经可以在单次实验中产生数太字节（TB）的数据，这给数据处理、分析和可视化带来了巨大挑战。
综上所述，空间组学被广泛认为是生命科学的新前沿，有望改变生物学的多个领域，并通过同时检测物理组织结构和分子特征来彻底改变病理学。虽然该领域在过去的5年里发展迅猛，但仍然面临一些挑战：进入技术壁垒，稳健性、实验设计及最佳分析实践不明确，以及缺乏标准化。该综述中，研究团队系统介绍了不同的空间组学技术，全面阐述了其优势及局限性，并给出了合理的建议。
本文由 SEQ.CN 作者：陈初夏 发表，转载请注明来源！
