科研

首页 - 全部文章 - 科研 - 测序周报 · 科研篇:“基因魔剪”致数百个非目标突变?学者:还无法排除其他可能

测序周报 · 科研篇:“基因魔剪”致数百个非目标突变?学者:还无法排除其他可能

基因魔剪”致数百个非目标突变?学者:还无法排除其他可能

导语:5月30日在线发表在 Nature Methods 上的一篇题为 Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo 的论文,使得基因编辑技术又一次受到广泛关注。来自哥伦比亚大学、斯坦福大学、艾奥瓦大学的研究人员通过全基因组测序发现,CRISPR-Cas9 编辑使得小鼠产生了上千个非目标基因突变。多家科学媒体对此研究进行了报道,学界和大众对 CRISPR 编辑基因的精准性、用于临床治疗的安全性,以及这项技术的发展前景产生了一系列关注与讨论,同时也有科学家对这篇通讯文章结论的可信度打上了问号。

近日,一篇发表于《自然 - 方法》期刊的通讯文章让不少人再次审视“基因魔剪”CRISPR 的安全性。在不到千字的正文中,来自美国哥伦比亚大学等机构的研究人员称,经 CRISPR 基因编辑的小鼠会出现数百个意想不到的非目标突变,认为可能是 CRISPR 的脱靶现象引起。

但有科学家对这篇通讯文章结论的可信度打上了问号。

“由于论文提供的实验证据有限,目前还不能得出 CRISPR/Cas9 具有更大安全隐患的结论。”中国科学院生物物理研究所研究员刘光慧表示。

中国科学院上海神经科学研究所研究员杨辉及其博士研究生唐骋持相同观点,在 6 月 2 日发表于微信公众号《知识分子》的撰文中,他们表示:“文章本身的实验和数据也只是展现一种可能性,但并不足以支撑起一个科学结论所需的完整逻辑结构。”

中国科学院动物研究所干细胞与生殖生物学国家重点实验室研究员李伟也表示:“这篇文章的方法和结果并不令人信服,仍需同行验证。”

经过锌指蛋白和 TALEN 两代基因编辑技术之后,借用自然界规律的后起之秀 CRISPR 因为技术门槛低、效率高,成为目前全球实验室最为常用的基因编辑技术。CRISPR 的中文全称是“成簇的规律间隔的短回文重复序列”,化用的是细菌免疫系统应对噬菌体的特殊机制,在向导 RNA 的带路下,Cas9 蛋白可对目标 DNA 片段进行切割。

通讯文章写了什么?

在 5 月 30 日在线发表于《自然 - 方法》的通讯文章中,研究人员表示,通过 CRISPR 基因编辑技术,他们将两只盲鼠的致盲基因进行修复。

修复后,通过全基因组测序,他们发现,与未经过 CRISPR 编辑的小鼠相比,两只经过改造的小鼠发生了 100 多个基因片段的插入或缺失(indel)、上千个单核苷酸突变(SNV)。其中,有 117 个基因片段缺失或插入和 1397 个单核苷酸突变是两只盲鼠共有的。研究人员认为,这可能是因为 CRISPR 编辑目标致盲基因时出现了脱靶现象。

基因编辑的脱靶问题并不是一个新事物,就算第三代基因编辑技术、有“基因魔剪”之称的 CRISPR 也没有完全避免。所谓脱靶,指的是基因编辑工具工作时,可能“伤及无辜”,除了人们想改变的目标基因外,无意中改变了其他基因。

自从 CRISPR 系统问世以来,科学家们不断在提高 CRISPR 系统的特异性,减少脱靶现象。目前,通过计算机模拟程序,实验室里的科学家可以预测基因组中可能的脱靶位点,并重点检查模拟结果中最可能脱靶的几个区域。

但研究人员发现,他们实验中发现的这些改变是计算机模拟软件所无法预测到的,从而建议业内今后使用全基因组测序的方法来检测体内编辑后是否有脱靶导致的突变。

同行为什么认为结论可信度不高?

首先是研究的样本量。“样本量太少,无法区分‘突变’的来源,是这个研究的最主要问题。”李伟说。作为一篇简短的通讯文章,研究人员所用来得出结论的数据仅来自两只实验鼠和一只对照鼠。

杨辉觉得这样的样本量是“严重不足的”,“因为你无法分清这个结果究竟只是这一两只动物的‘个案’,还是某种普遍的规律,而只有大量的重复才能抹平一只只小鼠的‘个性’,从中总结出最普适的结论。”

在刘光慧看来,缺乏合适的实验对照也使得该研究可能流于“个性”。该研究仅仅使用了 1 只非注射组小鼠作为对照,严格的实验设计应该包含更多的对照以排除不同小鼠之间固有的遗传差异。他表示,即便在同一组织内,细胞和细胞之间在基因序列上也可能存在着一定的差异(即异质性);这些个体、组织、细胞之间的差异需要谨慎地排除,不能简单将其归因为基因编辑所致的突变。

杨辉和刘光慧在实验对照组的设计改进上提出了类似的看法:为了严谨性和科学性,一方面,该研究应该同时包含基因编辑小鼠的父母系作为测序的对照,这样可以部分确认突变是来自遗传还是因为基因编辑。另一方面,由于 CRISPR 的工作机制是在向导 RNA 的带领下找到目标基因,再用 Cas9“剪刀”进行切割。该研究应该补充分别单独注入向导 RNA 和 Cas9 的对照实验,从而判断是否突变真的是由于 CRISPR 切割所造成的脱靶效应。

此外,值得注意的是,基因尤其是单核苷酸的突变在自然界无时无刻不发生着,这意味着研究人员需要排除突变是不是天工所为。“突变本来又会在 DNA 复制和细胞分裂的过程中自然发生,因此他观察到的突变有多少是由 CRISPR 引发的脱靶,是否广泛存在,仍然需要其他同行的验证。”李伟说。

利用全基因组测序的方法来评估基因编辑工具的脱靶效应,这是该通讯文章的创新之处,但刘光慧有他的担忧。

“在技术层面上,目前的全基因组测序会不可避免地报告少数‘假阳性’的突变结果,这些结果需要后续用生物信息学和 Sanger 测序等手段进一步‘过滤’和确证,才能最终得到确凿的结论。”刘光慧解释,理论上 CRISPR/Cas9 产生的大多数突变更有可能是插入缺失突变(indel),而该研究显示单核苷酸变异(SNV)似乎比插入缺失突变(indel)还要多,这些不寻常的现象需要格外加以关注。

总而言之,研究人员通过全基因组测序发现了以数百计的突变,然而,要将这些直观的“突变”与 CRISPR 的脱靶效应关联起来,建立确凿的因果关系,需要层层地排除其他可能性,方可定论。但目前,根据该通讯文章所呈现的实验设计、数据,诸多可能性尚无法排除。这也是刘光慧、李伟、杨辉为这篇通讯文章打上的最大问号。

科学家怎么看基因编辑的安全性争议?

对于基因编辑这一革命性的生物技术,安全性总是敏感地横亘在大众心头。此次《自然 - 方法》的通讯文章掀起波澜,让 CRISPR 技术相关的上市生物公司股价受到波动。

“在更多证据出来之前,我们既不能轻率地说 CRISPR/Cas9 有严重缺陷或是《自然 - 方法》登错了文章。”尽管对该通讯论文所得结论暂时保留意见,杨辉和唐骋表示:“CRISPR/Cas9 作为一种对人类未来命运休戚相关的重要生物技术,一些谨慎的声音总是很有意义的。”

李伟相信基因编辑技术具有重要临床应用前景,谈及基因编辑的安全性问题,他说:“任何生物技术,包括基因编辑技术在内,在临床的应用都需要经过严格的安全性和有效性评估,过度的乐观和轻易的悲观都是不利于其发展的,需要足够的耐心和毅力来制定严格的安全性和有效性评估标准并完成它。”

“基因编辑技术的安全性一直是临床试验不能回避的问题,在将基因编辑应用于临床试验之前,必须确定其安全性和有效性。”刘光慧说:“从积极的方面看,该论文再一次敲响了警钟,提醒人们要严格评估任何一种临床治疗方案的安全性。其实,这对于从事基因编辑研究的科研人员来说更多的是一种激励。”

来源:澎湃新闻

本周科研进展

1. 日前,斯克里普斯的研究团队成功根据现有的三种杀菌机制开发出一种全新的万古霉素,相关文章发表于PNAS上。研究表示,新抗生素对VRE和VRSA等微生物的杀菌性至少提高了2.5万倍。此外,与其他抗生素不同的是,当研究小组以万古霉素抗性细菌进行测试时,即使在50轮之后,微生物也没有产生抗药性。

2.日前,来自Wellcome Trust Sanger研究所的科学家发现了一种保护心脏免受心血管疾病的遗传变异,相关成果发表于Nature Communications。研究人员在希腊克里特岛的北部Mylopotamos村居民的基因中发现了一种可以保护心脏的新型遗传变异。这一遗传变异能功能性地降低血液中甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇的水平,从而降低个体罹患心血管疾病的风险。

3.近日,中国科学院心理研究所王晶研究组与北京大学第六医院王玉凤研究组、北京大学刘东研究组合作,在中国汉族儿童注意缺陷多动障碍(ADHD)患者中开展了国际首个ADHD执行抑制功能的全基因组关联研究,并发现了新的与ADHD执行抑制相关的易感基因。

4.近日,一项刊登于国际杂志Cerebral Cortex上的研究报告中,来自西南医学中心的研究人员通过研究鉴别出了和记忆相关的100多个关键基因,相关研究或为后期研究人员深入理解人类大脑记忆加工过程提供新的线索和希望。

5.一直以来,22号染色体的22q11.2区域是各类出生缺陷研究的热点。来自贝勒医学院的研究团队发现CRKL基因的重复或缺失是泌尿生殖系统缺陷的“罪魁祸首”。研究发现,在小鼠和人类中,该基因在泌尿生殖道的整个发育过程中都适度表达。这些结果让研究人员进一步确定CRKL基因与泌尿生殖缺陷的重要联系。

6.日前,一个由古代DNA专家组成的团队已成功对来自90个古埃及木乃伊的基因组进行了测序。这一突破性的结果让科学家们第一次对普通古埃及人的基因有了初步的了解。研究发表于Nature Communications上,这一结果向科学界证明了古埃及木乃伊中保存了人类DNA。

新发表文章

【新技术】

1. Millstone: software for multiplex microbial genome analysis and engineering.Goodman DB et al.Genome Biol. 2017 May 25

2. PipeCraft: flexible open-source toolkit for bioinformatics analysis of custom high-throughput amplicon sequencing data.Anslan S et al.Mol Ecol Resour. 2017 May 25.

3. RareVar: A Framework for Detecting Low-Frequency Single-Nucleotide Variants.Hao Y et al. J Comput Biol. 2017 May 25.

4. A Joint Bayesian Model for Integrating Microarray and RNA Sequencing Transcriptomic Data.Ma T et al. J Comput Biol. 2017 May 25.

5. ASAP: a Web-based platform for the analysis and interactive visualization of single-cell RNA-seq data.Gardeux V et al.Bioinformatics. 2017 May 24.

6. DTWscore: differential expression and cell clustering analysis for time-series single-cell RNA-seq data.Wang Z et al.BMC Bioinformatics. 2017 May 23

【微生物】

1. Molecular characterization of a novel luteovirus from peach identified by high-throughput sequencing.Wu LP et al.Arch Virol. 2017 May 26.

2. Prevalence and genomic characterization of Escherichia coli O157:H7 in cow-calf herds throughout California.Worley JN et al.Appl Environ Microbiol. 2017 May 26.

3. Development and Evaluation of Quality Metrics for Bioinformatics Analysis of Viral Insertion Site Data Generated Using High Throughput Sequencing.Gao H et al. Biomedicines. 2014 May 6

4. Genetic diversity of Mycobacterium tuberculosis isolates from Tochigi prefecture, a local region of Japan.Mizukoshi F et al. BMC Infect Dis. 2017 May 25

5. Expression profile of Epstein-Barr virus and human adenovirus small RNAs in tonsillar B and T lymphocytes.Assadian F et al.PLoS One. 2017 May 25

【肿瘤】

1. CT-Guided Bone Biopsies in Metastatic Castration-Resistant Prostate Cancer: Factors Predictive of Maximum Tumor Yield.Holmes MG et al.J Vasc Interv Radiol. 2017 May 24.

2. Severe hypertriglyceridemia due to two novel loss-of-function lipoprotein lipase gene mutations (C310R/E396V) in a Chinese family associated with recurrent acute pancreatitis.Lun Y et al.Oncotarget. 2017 May 10.

3. Genomic analysis of oesophageal squamous-cell carcinoma identifies alcohol drinking-related mutation signature and genomic alterations.Chang J et al.Nat Commun. 2017 May 26

4. "Omic" Approach in Non-Smoker Female with Lung Squamous Cell Carcinoma Pinpoints to Germline Susceptibility and Personalized Medicine.Baldassarri M et al.Cancer Res Treat. 2017 May 26.

5. Single cell DNA sequencing reveals a late-dissemination model in metastatic colorectal cancer.Leung ML et al.Genome Res. 2017 May 25.

6. Mitochondrial DNA sequencing and large-scale genotyping identifies MT-ND4 gene mutation m.11696G>A associated with idiopathic oligoasthenospermia.Ji J et al.Oncotarget. 2017 May 8.

【其他】

1. Translation of WNT developmental programs into stem cell replacement strategies for the treatment of Parkinson's disease.Toledo EM et al.Br J Pharmacol. 2017 May 26.

2. Gene dispersion is the key determinant of the read count bias in differential expression analysis of RNA-seq data.Yoon S et al.BMC Genomics. 2017 May 25

(0)

本文由 测序中国 作者:王迪 发表,转载请注明来源!

热评文章