近日，复旦大学附属中山医院邱双健、樊嘉、易勇、周佩云团队在Communications Biology上发表了题为“Single-cell and spatial architecture of primary liver cancer”的文章。研究团队利用scRNA-seq、空间转录组和批量多组学技术，阐述了3种PLC类型的分子架构。在高分辨率视角下，该研究发现CHC细胞表现出内部不一致的表型，而ICC和HCC表现出不同的肿瘤特异性特征。此外，研究团队还在肿瘤-肿瘤周围交界区发现了具有不同表型的中间状态内皮细胞（ECs）亚群，并分析了其空间分布模式。综上，该研究提供了对PLC微环境同质性和异质性特征的见解，有助于促进药物开发和相关病理研究。

研究团队从7例PLC（P121-P123 ICC, P124-P125 HCC, P126- p127 CHC）患者的部分新鲜肿瘤、瘤周和外周血中分离单细胞（SC），并收集了患者术后1个月的外周血以及P126患者部分转移性淋巴结，最终对27个样本进行了scRNA和scV(D)J测序（图1）。

经质量筛选，SC数据集包括289,156个高保真测序细胞和110,013个V(D) j测序细胞。依据细胞类型对SC数据进行聚类，共得到4个主要细胞群，由25个超簇组成。其中，64,443个细胞来自HCC，86,302个来自ICC，96,770个来自CHC。研究团队在4个主要细胞群中分别进行第二次聚类，得到更精确的子簇，用于进一步分析。

为探索PLC的空间异质性，研究团队对来自2个供体（P128HCC、P129 ICC）的5个额外组织切片进行了ST检测（图2）。共获得21,571个ST spot，单个spot平均包含10,995 UMI和3,092个基因。根据切片的组织结构，研究团队划分了4个带注释的空间区：肿瘤（T）区、瘤周（P）区、肿瘤-瘤周交界区（J）和基质（S）区。研究团队对scRNA-seq和ST数据进行了整合，使用相互最近邻（MNN）和多模态交叉分析（MIA）将单细胞簇与其空间位置相对应，发现大多数非实质细胞和免疫细胞位于S区或J区。

为扩大PLC分子结构的边界，研究团队对15个相匹配的实质组织进行多组学分析，从不同组学的角度进行无监督聚类以探究组织水平的异质性。结果显示，表观基因组学和代谢组学呈混沌分布，mRNA、lncRNA和蛋白质组学呈组织类型相关的分布，表明mRNA、lncRNA和蛋白质组学的变化对表型影响较大。

为解析不同区域的空间表达模式，研究团队对每个ST切片进行聚类分析，并使用UMAP可视化。结果显示，肿瘤组织的簇点在空间分布上更集中，而癌旁组织的簇点更为分散，这可能由肿瘤的克隆进化模式所致。UMAP图显示，簇点呈组织相关分布，其中J区的簇点聚集在一起，距离T和P区的簇点相对较远。上述结果表明，与表型相对一致的T区和P区相比，J区表现出相对复杂的空间表达模式，提示J区在细胞发育命运中可能具有特定的功能特征。

研究团队对三种不同类型的PLC进行并行分析，第一次聚类中与恶性细胞相关的三个超簇被分别标记为M1、M2和M3（图3）。结果显示，M1、M2和M3之间存在显著异质性，其中M2的G2M或S期增殖高于M1和M3，这种异质性也存在于肿瘤间和个体水平上。在第二次聚类后，M1在UMAP中被明确地分成19个亚簇，其中9个亚簇具有患者特异性，M2和M3的亚簇也是如此；这些患者特异性亚簇主要由恶性细胞组成。

研究团队依据PLC类型对特异性亚簇进行分析，并利用ST结合scRNA-seq数据，比较了HCC和ICC的表型差异。结果显示。HCC亚簇中存在异常代谢过程的富集，ICC亚簇表现出异常氧代谢和上皮-间质转化（EMT）的富集，CHC亚簇的基因富集涉及HCC和ICC亚簇。

研究团队利用SCENIC进一步分析了不同PLC肿瘤细胞的转录模式，发现CHC亚簇显示出与HCC和ICC中不同的由转录因子（TF）调控的活性调控。这些结果表明，HCC和ICC具有不同的肿瘤特异性特征；与其他两种PLC类型相比，CHC具有内部不一致的表型特征。

为研究PLC中成纤维细胞的分子特征，研究团队对超簇F重新聚类，并进行拷贝数变异（CNV）分析（图4），共得到8个亚簇（C1-C8），表现出不同的基因表达特征；亚簇中细胞的CNV比异质恶性细胞更少，表明其是癌症相关成纤维细胞（CAFs）。大多数亚簇处于活跃状态，并显示出已知功能，如血管发育、细胞外基质组织和对创伤的应答。

研究团队对来自不同肿瘤类型的CAFs分子特征进行了探索，发现ICC来源CAFs具有丰富的形态发生、骨骼发育和对生长因子应答等特征；HCC来源CAFs具有丰富的髓系白细胞活化和代谢过程特征；CHC来源的CAFs兼具上述两种特征。

研究团队还使用Monocle 2算法对CAFs进行伪时间排序。结果显示，ICC来源和HCC来源的CAFs 位于伪时间轨迹的两端，表明其在基因表达谱上存在差异；CHC来源的CAFs位于轨迹的中间，这证实其在基因表达谱中具有涉及ICC和HCC来源CAFs的双重特征。上述结果表明 ，CAFs的功能由肿瘤类型及其TME驱动。

图4. PLC中癌症相关CAFs的鉴定。

此外，研究团队还广泛分析了PLC中CAFs的单细胞分子特征，发现与其他两种类型相比，其在 ICC中更普遍；ICC中分布着较丰富的MYH11+ CAFs，这提示以CAFs为靶点的治疗策略可能在ICC治疗中更有效。

为绘制PLC的内皮细胞（ECs）图谱，研究团队对两个与ECs相关的超簇进行重新聚类，共获得15个亚簇，包括CLEC4G+肝窦ECs（LSECs）、肿瘤相关ECs（TAECs）、中间状态ECs和其他ECs（图5）。其中，TAECs具有肿瘤异质性，LSECs和中间状态ECs在肿瘤和个体水平上均未表现出明显异质性。

接下来，研究团队使用GSVA、Scenic、伪时间轨迹和RNA velocity分析了TAECs、LSECs和中间状态ECs在分子特征上的差异。结果显示，TAECs中富集了EMT、肌生成等标志性基因，中间状态ECs显著表达富集在早期和晚期雌激素反应中的基因，LSECs未表现出明显的标志或代谢基因集富集。此外，中间状态ECs具有来自LSECs和TAECs的双重功能潜力。

研究团队分析了中间状态ECs的功能是否与其空间分布模式有关。结果显示，与T区域或P区域相比，中间状态ECs更多位于J区域，这与其中间功能状态一致。综上，该研究确定了一群中间状态ECs，其功能状态介于LESCs和TAECs之间，这可能与其在J区域的空间分布有关。

综上所述，研究团队展示了PLC的详细情况，同时包括HCC、ICC和CHC，并涵盖了病毒特征和肿瘤大小的多样性。通过将单细胞转录组学、免疫组库、spot细胞ST和大组织多组学进行整合，为对不同类型PLC进行全面观察和平行比较提供了机会，并揭示了PLC微环境的分子特征，并提示肿瘤-肿瘤周围交界区可以作为精确治疗策略的靶向区域。