近年来，免疫检查点阻断（ICB）在癌症治疗方面取得了巨大的进展，特别是对于患有不可切除或转移性疾病的患者，ICB治疗有效延长了其无进展生存期。但ICB治疗成本较高、所用药物可能具有潜在毒性，并且仅有少数接受ICB的患者在治疗后表现出持久的免疫应答。因此，目前急需一种强大、实用的算法来预测ICB治疗效果。

已知的几种生物标志物，包括患者年龄、肿瘤类型和肿瘤突变负荷（TMB）年龄等与ICB反应呈正相关。其中，TMB是预测ICB反应最完善的标志物，通常根据靶向基因或外显子组测序（WES）数据计算得出。研究人员将特定的DNA突变与ICB反应相关联，试图通过WES研究超越TMB的生物标志物，但受到了样本量低和分析方法（全基因组）不足等方面的限制。

文章发表在Nature Communications上

研究团队汇总了六项已发表的针对黑色素瘤、非小细胞肺癌（NSCLC）、膀胱癌和头颈部癌症患者免疫治疗研究中的WES数据和实体瘤（RECIST）分类中的反应评估标准，共涉及319名患者。由于肿瘤类型不同，研究发现很大范围的免疫应答率，从6%到56%、部分或完全应答患者不等。（图1）

为研究ICB反应的基因组预测因子，研究团队将应答数据二分类，将完全和部分应答患者者视为“应答者”，将进行性疾病患者视为“无应答者”。对符合条件的不同肿瘤类型的TMB进行分层后，研究团队发现，黑色素瘤和NSCLC中的ICB反应有显著关联；ICB应答者和无应答者之间的年龄差异显著；年龄与其所包含的RECIST响应类别之间存在显著的正相关。

图1. 接受ICB治疗的患者的汇总队列。

先前对ICB反应的全基因组分析主要集中在全局突变模式上，因为ICB反应性肿瘤具有较高的新抗原负荷。但单个基因的功能突变也可能改变肿瘤细胞，使它们更具免疫原性或ICB抗性。为了确定可能介导ICB反应的功能突变，研究团队开发了“两阶段生物标志物发现法”：在第一个“特征选择”阶段，无论反应数据如何，确定队列中积极选择的基因。在第二个“生物标志物关联阶段”中，评估第一阶段得到的突变特征与多变量逻辑模型中免疫治疗反应的相关性。

为了在聚合免疫治疗队列中识别阳性选择基因和通路，研究团队改良了fishHook模型，并将fishHook应用于始终被WES捕获的19,688个基因的编码区域（图2）。最终，检测了129,344个高、中度影响突变，不包括癌症基因组图谱（TCGA）WES数据集中不到80%的患者碱基上发生的任何突变，并以q<0.1的显著性阈值确定了六个复发突变基因：BCLAF1、BRAF、KRAS、NRAS、PPP6C和TP53，其中四个（BCLAF1、KRAS、BRAF和TP53）在多次假设校正后仍具有显著的预测性。因此，BCLAF1、KRAS、BRAF和TP53是ICB反应的预测基因。

图2. 两阶段方法将BCLAF1体细胞基因型确定为ICB反应的预测因子。

接下来，研究团队将“两阶段生物标志物发现法”扩展到多基因生物标志物中，并将fishHook模型应用于Reactome数据库的基因集。特征选择阶段，研究团队在272个剖析病例中选择了199个反复突变的通路。在第二阶段，通过将年龄、肿瘤类型、TMB作为协变量，在类似于基因水平分析的逻辑回归模型中，将通路突变状态与ICB反应相关联。经过多次假设校正，研究团队将通路按重要性排序，并排除了与更重要的路径共享超过40%的基因的路径，最终得到21条通路。（图3a-b）

进一步，研究团队将这些通路中的基因与全基因组范围内进行的免疫逃逸CRISPR筛选进行了比较。结果显示，CRISPR筛选中的富集基因与其中7条通路有明显重叠（p53依赖性G1 DNA损伤反应，NOXA的激活和线粒体易位，伴侣蛋白介导的蛋白质折叠，RUNX3调节CDKN1A转录，MAP2K和MAPK激活，A类受体清除和整合素细胞表面相互作用），并且7条通路有4条包含TP53。（图3c-d）

图3：编码DNA损伤、免疫相关和MAPK通路基因中的体细胞突变与ICB反应相关。

研究团队将上述7条通路与4个显著的预测基因、基线特征（年龄、TMB和肿瘤类型）相结合，构建了预测癌症免疫治疗反应的工具CLassifiEr（CIRCLE）。为对CIRCLE进行基准测试，研究团队将其与FaitlamOne CDx（FO）的模拟版本进行了比较。FO通过计算323个基因组中的非同义和蛋白质编码突变来估计TMB，是经FDA批准的伴随诊断产品。

结果显示，CIRCLE的预测结果优于FO-TMB，CIRCLE和FO-TMB之间的AUC差异相似。同时，研究团队还计算了CIRCLE和FO-TMB的灵敏度、特异性、精度以及F1评分，当使用CIRCLE时，敏感性提高10.5%，特异性提高11.0%，F1评分增加14%。（图4）

综上所述，为确定预测ICB反应的基因和通路生物标志物，研究团队分析了六个具有不同肿瘤类型的WES队列。该研究专注于在表观遗传、复制时间和基于序列的协变量校正后显著突变的基因和通路，确定了可作为ICB反应预测因子的4个基因和7个通路，并开发了预测癌症免疫治疗反应的CIRCLE。

参考文献：

1.Gajic, Z.Z., Deshpande, A., Legut, M. et al. Recurrent somatic mutations as predictors of immunotherapy response. Nat Commun 13, 3938 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-31055-3

2.Whole exome sequencing predicts whether patients respond to cancer immunotherapy

https://medicalxpress.com/news/2022-07-exome-sequencing-patients-cancer-immunotherapy.html