肿瘤微环境 (TME) 在肿瘤进展中发挥着关键作用。最新的单细胞分析结果虽然揭示了TME的细胞异质性，但人们对TME内形成的多细胞结构仍知之甚少。此外，已有大量研究证明，多细胞空间组织的特征会影响肿瘤的表型和治疗的反应。

目前，高度多路成像技术的发展使得科研人员能够在空间结构背景下对特定组织进行精确的细胞分类，并已成功应用于多种实体肿瘤的TME解析，但对乳腺肿瘤中TME结构全面且系统性的分析仍然匮乏。

近日，剑桥大学的研究团队在Nature Genetics发表了题为“Breast tumor microenvironment structures are associated with genomic features and clinical outcome”的文章。研究团队使用成像质谱流式技术（Imaging Mass Cytometry, IMC）结合来自693名乳腺肿瘤患者样本的基因组、临床数据进行了多维空间分析，揭示了乳腺肿瘤中TME结构分布及其与基因组特征和临床结果的关系。该研究系统绘制了TME的原位结构，并确定了10个具有不同富集模式的复发性TME结构，其中一些结构与指示免疫逃逸的基因组谱相关。该研究揭示的多细胞结构将保守的空间组织与局部TME功能相结合，可以用于改善患者分层，也为未来理解癌症组织的空间组织原理奠定了基础。

为了解TME在乳腺癌中的功能状态，研究团队使用IMC与一系列抗体组合检测了涉及血管和基质异质性、抗原呈递、髓系和淋巴系的蛋白质，以识别TME细胞类型及其空间关系。免疫检查点蛋白抗体、共刺激蛋白以及细胞增殖和凋亡标记物被纳入以检测细胞的激活状态，针对细胞角蛋白和典型乳腺癌蛋白的抗体同样被纳入以评估癌细胞的异质性。研究团队使用抗体标记了METABRIC研究中693名乳腺癌患者的组织芯片（TMA）切片，并对染色玻片进行IMC分析，生成了高维图像。（图1）

图1. 乳腺癌TME的高维图像解析。来源：Nature Genetics

乳腺肿瘤组织中细胞表型的关键区别是上皮细胞还是非上皮细胞，后者属于TME。为了更准确地进行区分，研究团队采用泛细胞角蛋白（pan-CK）表达的高斯混合物建模和通过使用机器学习对所有角蛋白（pan-CK、CK5和CK8-18）进行捕捉以识别细胞。将细胞区分为上皮细胞或非上皮细胞后，研究团队基于多维蛋白表达数据定义了细胞表型，对主要的TME细胞类型（淋巴细胞，骨髓细胞和基质细胞）进行了亚分类。（图2）

乳腺癌的分子亚型反映了肿瘤间的异质性，也被认为具有不同的肿瘤生态系统特征。研究团队分析了乳腺癌亚型的生态系统多样性是否在上皮细胞或TME细胞的贡献方面存在差异（图2d）。经多次检测调整后，研究发现乳腺癌亚型间上皮细胞多样性差异不大，TME细胞多样性差异显著。

图2. TME细胞类型的识别。来源：Nature Genetics

实体瘤由多个小隔室组成，隔室包括肿瘤组织、间质和血管。位于隔室界面的细胞可能参与相互的信号传递，也可能因为分泌因子而迁移到隔室界面，这两种方式都会影响TME结构。为了分析TME在空间构成的复杂性，研究团队将细胞分为接触界面和不接触界面两类，并使用广义线性模型对两类细胞的构成进行比较。

结果显示，所有的TME细胞类型都在肿瘤-基质界面显著富集或缺失，不同细胞类型在富集或缺失程度上存在显著差异。肌成纤维细胞（包括表达PDPN的细胞）在界面显著富集，而成纤维细胞和内皮细胞数量减少；部分淋巴样细胞表型（CD4+ T细胞，CD8+T细胞、CD38+淋巴细胞和B细胞）也在界面上缺失，其中B细胞在所有细胞类型中缺失的程度最大。

图3. 组织界面的细胞表型转变。来源：Nature Genetics

此外，研究团队还探索了血管周围细胞在TME与其他细胞中的差异。循环白细胞通过血管周围间隙浸润TME，外周血和引流淋巴液中的可溶性因子也可能影响血管周围细胞的数量。研究团队将血管周围细胞定义为直接与血管接触的细胞，并将其组成与其他TME细胞进行比较。

与预期结果相同，血管周围细胞由内皮细胞大量富集，除内皮细胞外，血管周围细胞类型最丰富的是CD38+淋巴细胞，这一结果可能与CD38介导淋巴细胞与内皮细胞的粘附有关。在肿瘤间质界面，CD4+、CD8+ T细胞和巨噬细胞都表现出血管周围的缺失；基质细胞中，PDPN+肌成纤维细胞、FSP1+成纤维细胞和成纤维细胞数量减少。

基于上述发现，研究团队认为与血管周围空间相关的表型转变可能是循环白细胞进入组织和邻近基质激活的结果，肿瘤-基质和血管界面都会影响TME结构。此外，细胞的富集和缺失模式表明，不同的功能在TME内是存在空间分离的。

图4. 组织界面的细胞表型转变。来源：Nature Genetics

最后，研究团队探索了TME结构是否能够预测临床结局，评估了与每个TME结构相关的疾病特异性生存风险比。由于先前研究显示浸润性白细胞对雌激素受体（ER）阳性和ER阴性乳腺癌患者的预后影响显著不同，因此，研究团队根据ER状态进行了独立分析。

结果显示，TME结构与ER阳性疾病的预后显著相关，与ER阴性疾病的结局没有显著相关性。在与ER阳性肿瘤预后相关的四种结构中，三种与预后不良相关（粒细胞富集、APC富集和扩张抑制），一种与预后良好相关（血管基质）。上述结果表明，TME是影响临床结局的关键因素，不同的TME结构提供了互补的预后预测价值。结合在临床中应用的多个参数，TME结构的加入有可能进一步提高预测的准确性。

图5. TME结构对临床预后的影响。来源：Nature Genetics