肝脏是人体中最大的实体器官，但目前大多数肝细胞类型和精确定位仍是未知的。此外，肝脏转录组和蛋白质组之间的联系尚未得到研究。近日，比利时根特大学Martin Guilliams研究团队在Cell上发了题为“Spatial proteogenomics reveals distinct and evolutionarily conserved hepatic macrophage niches”的研究文章。研究团队结合单细胞CITE-seq、单核测序、空间转录组学和空间蛋白质组学技术，绘制了一个健康/肥胖的人类和小鼠肝脏单细胞空间蛋白质基因组图谱，多组学数据提供了有效的策略来辨别和定位肝细胞，包括脂质相关巨噬细胞（LAMs）群体。研究团队将该图谱应用于七个物种，揭示了真正的Kupffer细胞（肝巨噬细胞）和LAMs的保守程序。

单细胞转录组学技术使人们能够更好地了解不同器官的细胞组成。为了生成肝脏的蛋白质基因组图谱，研究人员首先借助小鼠肝脏比较了单核RNA测序 （snRNA-seq）和单细胞RNA测序（scRNA-seq），发现两种技术都可检测不同的细胞组成，其中snRNA-seq能重现检测到的细胞频率。

为了研究单细胞分辨率下的mRNA和蛋白质表达，研究人员对18个样本（7个体外，11个体内）进行了CITE-seq分析，利用差异表达的基因（DEGs）和蛋白质（DEPs）确定了17种细胞类型。结果表明，在CITE-seq分析中添加抗体可以识别所有细胞的表面标记，包括Kupffer细胞 （KCs）的VSIG4和FOLR2，且不影响转录组数据的质量（图1）。

为了定位细胞，研究人员从两个不同的方向切割肝脏，并用Visium进行了空间转录组学分析。为了以单细胞分辨率验证这些空间位置，研究人员利用共聚焦显微镜来确定最佳细胞特异性表面标记。同时为了筛选多种抗体以识别通过显微镜起作用的抗体，进行了第二次Visium 分析。

蛋白质表面标记检查树突状细胞（cDCs）或巨噬细胞特异性mRNA的表达，证实了门静脉cDC1s、cDC2s和非Kupffer细胞的存在。为了更好地理解这些非Kupffer细胞，研究人员在11个群体的sc/snRNA-seq中分析了骨髓细胞，确定了肝巨噬细胞包括 Kupffer细胞、非Kupffer细胞等细胞亚群，亚群功能各异且存在于不同的生态位中。对非Kupffer细胞的分析发现，cluster8细胞簇类似于 Gpnmb+Spp1+脂质相关巨噬细胞（LAMs），位于胆管周围（图2）。

图2.健康小鼠肝脏的胆管周围有大量巨噬细胞，来源：Cell

由于巨噬细胞群与其局部环境中的CD45-细胞密切接触，研究人员进一步分析了CD45-细胞，确定了ECs和SCs的多个亚群。ECs可以进一步细分为4个不同的clusters，分别是ECs（cluster 10）、LSECs（cluster 9）、PV ECs（cluster 11）和淋巴ECs（LEC；cluster 12）。Visium在PVS和CVs中都发现了成纤维细胞，进一步分析SCs揭示了胶囊的间皮细胞和成纤维细胞的亚群。这些不同空间位置ECs和SCs的存在突出了不同巨噬细胞种群所在特定微环境的独特性（图3）。

图3.肝巨噬细胞群分布在不同的生态位中，来源：Cell

为了确定巨噬细胞亚群之间的保守程度及其在小鼠和人类肝脏之间的不同微环境生态位，研究人员利用sc/snRNA-seq和CITE-seq对肝脏活检生成了人类肝脏的蛋白质基因组图谱。

研究人员分析了人类肝脏巨噬细胞异质性，确定了10个clusters。通过检查检测Kupffer细胞基因的表达，确定了cluster10是真正的人类Kupffer细胞。虽然单独的VSIG4表达不能准确识别人类肝脏中的Kupffer细胞，但发现VSIG4蛋白是CITE-seq数据中人类Kupffer细胞的最佳标记物。为评估Kupffer细胞在进化中是否保守，对猕猴、猪、仓鼠、鸡和斑马鱼的肝脏进行分析发现，物种间转录组的重叠可能是由于核心Kupffer细胞转录因子的保守表达（图4）。

图4.物种间鉴定Kupffer细胞，来源：Cell

除了Kupffer细胞，研究团队还在肝囊中发现了人类CD68+VSIG4-巨噬细胞。通过scRNA-seq数据并与小鼠特征进行比较，确定了未成熟和成熟的LAMs，从而能够定义保守的LAMs特征。该研究在所有使用scRNA-seq分析的患者中都发现了LAMs，在2个脂肪变性>10%的肝脏中，LAM的比例有增加的趋势。在脂肪变性的人类肝脏中，LAMs主要位于中央周围，与脂肪变性相关，表明LAMs在脂肪变性肝中的位置是动态的。

进一步分析发现，人和小鼠之间存在多个保守的配体-受体。且Kupffer细胞（ALK1）和星状细胞（BMP9/10）之间的ALK1-BMP9/10回路在7个物种中都是保守的，研究人员预测其可能控制表达许多保守的Kupffer细胞转录因子。为了验证，研究人员培养了Fcgr1-Cre x Acvrl1fl/fl小鼠，从巨噬细胞中消除ALK1导致VSIG4+Kupffer细胞几乎完全丧失，这验证了NicheNet的预测，表明进化上保守的ALK1-BMP9/10轴对于肝脏中Kupffer细胞的存在至关重要（图5）。

图5. ALK1-BMP9/10轴调控Kupffer细胞的发育，来源：Cell

综上所述，研究团队绘制人类和小鼠的肝脏单细胞空间蛋白质基因组图谱，揭示了稳态Kupffer细胞的保守和独特的转录组；通过揭示肝细胞的空间定位，确定了健康小鼠、人类和猕猴肝脏胆管周围的 LAM。当脂肪变性时，LAMs 优先被富集到肝脏的脂肪变性区域。

参考文献：

Guilliams M, Bonnardel J, Haest B, et al. Spatial proteogenomics reveals distinct and evolutionarily conserved hepatic macrophage niches. Cell. 2022;185（2）:379-396.e38. doi:10.1016/j.cell.2021.12.018