在DNA水平探索表观遗传学可以增进我们对不同阶段表观基因组的了解。其中，获取甲基化和染色质可及性等动态变化信息对于分析表观特征有着重要意义。纳米孔测序（Nanopore sequencing）是一种新兴的单分子测序技术。利用纳米孔测序进行快速、准确、高精度及高通量的DNA测序是后基因测序时代的热点之一。已有研究表明，纳米孔测序可准确检测内源性CpG甲基化，也能够对染色质可及性位点进行外源标记。那么纳米孔测序能否同时检测这两种信息呢？

为实现这一目标，美国约翰霍普金斯大学研究团队基于纳米孔测序技术开发了一种能够同时检测CpG甲基化和染色质可及性的测序方法——nanoNOMe-seq。该方法可利用GpC甲基转移酶外源性标记开放染色质，并通过纳米孔测序检测长链DNA上的CpG甲基化和染色质可及性状态。通过对四种人类细胞系进行分析，研究团队构建了包括CpG甲基化和染色质可及性等信息的人类表观基因组图谱，并揭示了乳腺癌细胞和非癌细胞之间的甲基化和染色质可及性差异。相关研究成果已发表在Nature Methods上。

文章发表于Nature Methods期刊

该研究使用的NOMe-seq技术是Active Motif公司于2012年开发的一种新测序技术。该技术可利用外源性GpC甲基转移酶标记基因组可及性区域，结合亚硫酸氢盐转化，在全基因组范围内，检测同一个DNA分子中的甲基化小状态和核小体定位信息。基于该技术，研究团队首先对已有的nanopolish软件进行优化，使其能够同时准确检测CpG甲基化和GpC甲基化。然后应用GpC甲基转移酶外源性标记开放染色质，利用纳米孔技术对细胞进行NOMe-seq测序，即nanoNOMe-seq分析。

结果显示，nanoNOMe-seq检出的CpG甲基化与WGBS结果高度一致。通过分析GpC甲基化频率得出的染色质可及性数据与ATAC-seq、DNase-seq结果基本一致。

图：nanoNOMe-seq概述与评估，来源：Nature Methods

随后，研究团队利用同一DNA分子邻近GpC基序信息估计了特定位点的染色质可及性。通过评估单个reads上的多功能转录因子（CTCF）结合位点的可及性和甲基化，结果显示，该方法可以降低测序误差，并保留对核小体的追踪。同时，研究发现，在高表达基因的转录起始位点（TSS）附近核小体定位有序，染色质开放水平更高，并且利用nanoNOMe-seq还可获得与活性启动子状态相关的蛋白结合信息。

利用nanoNOMe-seq方法，研究团队构建了人类细胞基因组DNA甲基化和染色质可及性的全基因组等位基因特异性图谱，分析比较了常染色体基因、X染色体失活基因和逃逸基因在TSS附近的甲基化和染色质可及性。研究发现，在父系和母系等位基因的甲基化和染色质可及性存在显著差异的区域，两者重叠区域（6%）表现出甲基化增加，染色质可及性降低的高度一致性趋势。此外，多数结构差异在等位基因间的甲基化水平上无显著差异，缺失突变的基因表现出低甲基化，插入突变的基因则表现出高甲基化。

研究团队将该方法进一步应用于乳腺癌模型，经表观遗传分析发现，乳腺癌细胞系（MCF-7，MDA-MB-231）主要表现为低甲基化；乳腺上皮细胞MCF-10A的染色质可及性区域多于两种乳腺癌细胞。并在两种乳腺癌细胞中发现1个特异性基因插入突变，其下游区域表现出高甲基化和染色质不可及性，表明该乳腺癌细胞基因组变异与表观遗传状态相关联。

在这项发表在Nature Methods的最新研究中，研究团队利用新建立的nanoNOMe-seq技术，实现了CpG甲基化状态和染色质可及性的同步检测，并确定了单个分子上的组合启动子表观遗传学特征。纳米孔长读长测序使将reads稳固地分配给单倍型成为可能，从而使我们能够在单分子水平生成完全定相的人类表观基因组，用于表征复杂的表观遗传信息，为深入了解表观基因组的复杂性提供新的视角。

参考文献：

Lee, I., Razaghi, R., Gilpatrick, T. et al. Simultaneous profiling of chromatin accessibility and methylation on human cell lines with nanopore sequencing. Nat Methods (2020). https://doi.org/10.1038/s41592-020-01000-7