干货分享 | 详谈肿瘤免疫生物标志物优缺点及新型标志物——肿瘤发炎指数（TIS）

戴胜其它 2020-11-05

11月1日，NanoString Technologies, Inc.与深圳裕策生物科技有限公司共同宣布达成战略合作协议，携手拓展中国肿瘤免疫CRO市场。根据协议，NanoString 已授权裕策生物作为TIS（Tumor inflammation signature，肿瘤发炎指数）分析软件的中国首家CRO服务商，双方将在此基础上共建中国首个肿瘤免疫示范实验室。

根据合作内容，裕策生物将在原有的分子技术平台和病理平台上，通过引入Nanostring的GeoMx® Digital Spatial Profiler 系统和nCounter® FLEX 系统，在深圳市共建基于多组学技术的肿瘤免疫示范实验室，为国内生物医药企业和科研单位提供从靶点发现到上市后伴随诊断开发的一站式肿瘤免疫新药研发服务。

那么由裕策生物获得中国首家授权的肿瘤发炎指数（TIS）在肿瘤免疫疗法临床研究中有怎样的影响呢？今天小编就为大家分享一下肿瘤免疫疗法相关的潜在候选生物标志物及新型标志物——肿瘤发炎指数（TIS）的相关研究。

近年来，免疫治疗成为肿瘤临床研究的热点，并在逐步改变肿瘤临床治疗格局的改变，开启肿瘤治疗新纪元。肿瘤免疫治疗的基础在于靶向治疗与相应的伴随诊断能否对癌症病灶进行精准识别和打击。目前，已进行深入研究的有效候选生物标志物有很多，包括PD-L1表达，微卫星不稳定性（MSI），肿瘤突变负荷（TMB）, 错配修复缺陷（dMMR）以及肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）等等。其中，多个基于PD-(L)1蛋白表达的肿瘤免疫治疗药物已获得了FDA及NMPA的批准上市，但目前依然未有类似的有效并且具有广泛性的生物标志物，因此寻找新的候选生物标志物来加强肿瘤免疫疗法的临床效益仍迫在眉睫。

01 PD-L1免疫组化

近年来，随着PD-1/PD-L1抑制剂的获批，晚期非小细胞肺癌（NSCLC）的治疗在免疫疗法领域一枝独秀，无论是对病人的生存期抑或缓解率都有极大提高。在临床上，医生也通过PD-L1表达水平来选择合适的治疗人群。多个临床试验数据如CheckMate-012、KEYNOTE-001等均表明，患者对PD-1抑制剂的客观缓解率（Objective Response, OR）与PD-L1水平呈正相关。目前PD-L1蛋白表达主要通过免疫组化，即Immunohistochemistry （IHC）来实现。根据NCCN指南，在晚期NSCLC患者一线治疗前，需要检测驱动基因突变状态并根据其突变状态选择相对的靶向药物。而对于没有驱动基因突变的患者，应进行PD-L1免疫组化检测。

虽然PD-L1蛋白表达免疫组化已被广泛接受为PD-1/PD-L1通路抑制剂的有效生物标志物，但目前市面上仍然未有统一标准的检测方法。现行的5种PD-L1免疫组化检测试剂可在两个免疫组化平台DAKO和Ventana进行检测, 但每种抗体评价的阈值和染色水平均有所不同。

来源: Abcam中国

例如，默沙东的K药（Pembrolizumab）使用的伴随诊断试剂盒为DAKO公司的22C3抗体，其判定标准是肿瘤细胞中的PD-L1表达>50%，但在二线治疗中，K药的伴随诊断的判定标准为PD-L1表达>1%。百时美施贵宝的O药（Nivolumab）伴随诊断使用的也来源于DAKO公司，但属于不同源的28-8抗体。更复杂的是，随着更多研究发现肿瘤微环境与其他免疫细胞在免疫疗法中的作用，PD-L1表达水平的评价亦相应地被延伸至免疫细胞中。例如罗氏的T药（Atezolizumab）伴随诊断使用Ventana公司的SP142抗体，它不仅需要评价肿瘤细胞，还要评价免疫细胞。

即便是PD-L1表达，在应用于更广大的病人群体时依然存在重重困难。首先，不同肿瘤的PD-L1表达不同。其次，PD-L1的表达可能会随着治疗的进展而发生改变。最重要的是，即便在PD-L1表达低的病人群体中，依然有显著客观缓解和生存期延长的案例存在，那么单纯地使用PD-L1表达这单一生物标志物，也存在错失治疗良机的危险。目前，免疫疗法领域的四大巨头包括罗氏、默沙东、阿斯利康和百时美施贵宝已经就PD-L1表达的系统化和标准化开展了蓝印计划（Blueprint），目的在于探明各个平台及抗体的一致率。

02 微卫星不稳定性

近年来，另一个吸引了众多注意力的肿瘤免疫生物标志物当属微卫星不稳定性（Microsatellite Instability， MSI）。MSI广泛存在于多种恶性肿瘤中，其中在结直肠癌中的研究尤为深入。

微卫星（Microsatellite）指的是广泛分布于原核和真核生物基因组中的短的串联重复序列，约占人类基因的10%，核心序列为1-6bp。多位于基因非编码区以及染色体的近端粒区，在人群中表现为高度多态性。微卫星不稳定性（MSI）指基因组中短串联重复序列次数的增加或者减少，反映了由于错配修复基因（MMR）异常导致的DNA复制错误。MSI可以根据程度被分成高微卫星不稳定性（MSI-H, MSI-high），低卫星不稳定性（MSI-L, MSI-low）和微卫星稳定（MSS）三类。

1997年，美国国家癌症研究所（National Cancer Institute，NCI）推荐采用BAT-25、BAT26、D5S346、D2S123和D17S250五个微卫星位点作为MSI的标准。用同一个体的肿瘤组织PCR扩增产物和正常组织比较，假如2个及2个以上位点出现不稳定，则该肿瘤组织作为MSI-H。一般来说，大约有15%的散发性结直肠癌存在MSI-H。在2015年的《新英格兰医学杂志》上，由DT Le等人发表的研究显示，带有MMR的结直肠癌病人较无MMR病人对PD-1抑制剂的临床效用更好。目前，美国FDA已经批准了K药和O药用于dMMR/MSI-H结直肠癌患者的治疗，因此，MSI也正式进入到免疫疗法伴随诊断生物标志物的候选大军中。

检测MSI或MMR的方法可通过PCR、二代测序以及免疫组化等一个或多个进行。目前应用最广泛的是Promega公司以PCR为基础的MSI检测。该方法通过扩增肿瘤组织的DNA片段，再与正常的DNA做对比，通过NCI选定的5个MSI位点进行检测。另一方面，临床上亦会采用免疫组化对MSI检测进行补充。IHC是MSI检测的补充策略，原理是大多数MSI-H患者会有一个MMR基因相关蛋白的表达缺失。如果某种蛋白没有表达，就可以针对对应的基因做突变分析。两者相结合，可减少遗漏的可能性。

MSI检测已经广泛应用于结直肠癌患者的临床治疗，在其他肿瘤中的应用仍在探索中。尽管MSI也存在于其他恶性肿瘤，例如子宫内膜、卵巢、皮肤、脑肿瘤和上消化道肿瘤中，但仍然缺乏统一的位点。即便如结直肠癌，仍然有高达85%的病人缺乏有效的生物标志物，未能受益。因此MSI目前的适应症仍仅限于结直肠癌。

03 肿瘤异质性

目前，肿瘤免疫学界基本上认同肿瘤的变异越多，免疫疗法的效用越好。然而值得注意的是，除了肿瘤突变负荷（TMB），肿瘤微环境中还存在其他具有指向性的指标，如肿瘤浸润免疫细胞（Tumor Infiltrating Lymphocytes，TIL）以及肿瘤异质性（Intra Tumor Heterogeneity，ITH）。近期，来自以色列魏茨曼科学研究院的Yardena Samuels与美国国家癌症研究所的Eytan Ruppin联合团队报道了一项研究成果，与TMB相比，ITH对免疫疗法反应的指示性可能更具有临床意义。这项重要的研究成果发表在顶级期刊《细胞》。

首先，研究人员发现在TCGA数据库中，黑色素瘤患者的TMB和基因的拷贝数变异与患者的生存率没有相关性。但是肿瘤异质性低的患者，生存期却明显好于异质性高的。进一步分析发现，异质性高且TMB或拷贝数变异低的患者，生存率反而最差。控制潜在的混杂因素之后，这个结果仍然成立。

来源：UVB-Induced Tumor HeterogeneityDiminishes Immune Response in Melanoma. Cell. 2019

接下来，研究团队发现，经过UV射线处理的黑色素瘤细胞株与未经过处理的细胞株相比，在小鼠中的生长更为迅速并更有侵略性，并且对PD-1抑制剂的反应更差。理论上，这些经过UV射线处理的细胞株具有更高的TMB，应该更容易被免疫系统消灭才对，但这惊人的发现证明了TMB并非该研究中黑色素瘤患者免疫疗法生物标志物的指标，在某些情况下还可能反其道而行之。

研究团队的进一步分析发现，UV射线处理不仅导致了更多的TMB，也产生了更高的ITH，也就是说肿瘤中不同细胞的克隆随着TMB的产生也变多了（如下图所示）。当研究人员把单个细胞克隆分离出来后再注射到小鼠身上，经过UV射线处理的黑色素瘤细胞即便是有着极高的TMB，也都又失去了侵略性，说明ITH有可能是抑制免疫反应的元凶。

来源：UVB-Induced Tumor HeterogeneityDiminishes Immune Response in Melanoma. Cell. 2019

那么这种变化与TMB本身有什么区别呢？必须澄清的一点是，虽然TMB和ITH“你中有我，我中有你”，但TMB高的肿瘤ITH也可能低；而一个ITH高的肿瘤也可以有很低TMB。这个说法虽然听起来自相矛盾，但事实上假如一个肿瘤里面的所有细胞都是同一个细胞的克隆，那么就算这个肿瘤细胞里面有上万个突变，ITH都为零的。另一方面，一个肿瘤亦有可能存在几百个不同的克隆，但每个细胞克隆中都只有一个突变，那么这个肿瘤虽然有很高的ITH，但TMB却很低。如下图所示，左边肿瘤ITH高，右边肿瘤ITH低。

来源：UVB-Induced Tumor HeterogeneityDiminishes Immune Response in Melanoma. Cell. 2019

对于这一创新发现，研究人员认为ITH高的肿瘤的新抗原被大量稀释了，反而失去了对免疫系统的激活，具体表现为免疫细胞在癌组织中的浸润减少，大量的T细胞在进入癌组织的时候早早被外围的癌细胞抗原吸引，反而无法进入到癌组织的核心地带。另一方面，ITH高的肿瘤的T细胞毒性相关基因表达大量下降，证明T细胞对癌细胞的攻击受影响。

最后，研究人员综合分析了四个临床研究中PD-1抑制剂或CTLA-4抑制剂治疗的患者生存率，发现患者生存率与ITH而不是TMB密切显著相关。

那么ITH是否会成为下一个肿瘤免疫学里程碑式的生物标志物呢？

目前，该项研究主要集中在黑色素瘤的临床样本和小鼠模型中，具体的临床效用还需更大量的数据支持。另外，研究人员在该项研究中还发现，除了肿瘤细胞本身的特异性和突变负荷，免疫细胞的丰度以及各项炎症指标也与肿瘤生长速度以及对PD-1抑制剂的反应有显著相关，但依然需要通过免疫组化和细胞流式等传统方法来确定。最后，ITH虽然可以与TMB结合使用作为一种临床指标，但是两项检测都需要应用二代测序，对全外显子以及单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism, SNP）进行长时间的生物信息分析，且费用也相对PD-L1免疫组化和MSI检测更为昂贵，因此目前难以应用于广泛人群。

04 肿瘤微环境

在肿瘤微环境中，免疫细胞的丰度和炎症指标是不可忽略的因素之一，即便ITH结合TMB亦未能全面反映免疫反应。如下图所示，肿瘤细胞和免疫细胞之间的反应极其复杂。以IFN-gamma 为例，一方面它是杀死肿瘤细胞的强力武器，另一方面大量的IFN-gamma的释放又会造成PD-L1在肿瘤细胞或者巨噬细胞上的表达，反而抑制了T细胞的效用。因此，单一的生物标记物，如PD-L1蛋白表达，难以全面反映肿瘤微环境中的状况。

肿瘤发炎指数（Tumor Inflammation Score）主要标记物及通路，来源：NanoString Technologies

即便是T细胞与癌细胞的接触过程，本身也是混杂了大量的其他因素，例如趋化因子的释放，树突状细胞和巨噬细胞的抗原表达等。成功的肿瘤免疫反应所需的因素远远多于PD-L1和PD-1免疫检查点的抑制反应（下图所示）。研究人员需要更多考虑的是，除了PD-L1和PD-1之外，还有哪些因素在这个过程中会起到决定性的作用。并且这些因素必须能够体现在临床效果上，特别是免疫检查点抑制剂的生存效应，是否能够有效区分反应者（responder）与非反应者(non responder)。