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Science Advances丨新型数字PCR技术可在3小时内测定“端粒”单分子绝对长度

近日,由新加坡国立大学Lih Feng Cheow领导的研究团队于Science Advances杂志发表了一篇题为“Massively parallel single-molecule telomere length measurement with digital real-time PCR”的研究论文,报道了一种名为“STAR”(single telomere absolute-length rapid)的实时定量数字PCR端粒检测方法,可以利用较低的起始DNA量(<1 ng)在不到3小时的时间内测量端粒的绝对长度。研究数据表明,这种新颖的高通量数字PCR方法准确、灵敏,并且可以进一步帮助测量在癌细胞中发现的染色体外端粒重复序列(ECTR)。

“我们的创新可以极大地提高诊断速度,同时为年龄相关疾病和癌症提供关键的端粒信息。这样一项可靠的临床工具能够提供准确的端粒分析,进而为患者提供精准治疗和针对性的疗法。”论文通讯作者、新加坡国立大学生物医学工程系教授Lih Feng Cheow表示。“我们希望这种简单而全面的分析方法能够作为端粒的标准测量方法得到广泛采用。”研究团队还在论文中写到。

端粒是每个染色体末端的重复核苷酸序列区域,人类端粒由短串联重复序列(5'-TTAGGG-3')组成。完整的端粒结构和它重复的六聚体序列可保护末端免于降解,是调节染色体完整性的重要结构。端粒的六聚体序列的数量会随着细胞的每一次分裂而减少,导致在生物体的整个生命过程中,端粒长度在不停地缩短。在一定数量的细胞分裂后,端粒达到临界长度并触发不可逆的细胞周期停滞,称为细胞衰老。越来越多的证据表明,端粒长度异常与许多衰老相关疾病有关,如糖尿病、退行性疾病、心血管疾病以及各类癌症的不同预后。这些证据都支持端粒长度可以作为一种可用于衰老相关疾病和癌症研究的有潜力生物标志物。

尽管测量端粒的长度和监测端粒长度的动态变化在健康群体和疾病的发展上越来越引起人们的关注,但事实上,是由于缺乏简单、快速且可扩展的测量方法,临床上端粒的常规分析仍然面临巨大挑战。例如,现有的端粒长度测量方法在技术上要求较高,并且是基于使用任意均一化方法进行的相对测量,在各个实验室之间标准化程度很低。涉及Southern印迹流程的末端限制性片段(TRF)分析被认为是端粒分析的金标准。但由于该方法需要大量的基因组DNA起始量(至少1μg)和繁琐的实验过程,因此不适合临床应用。另一方面,以实时定量PCR为基础的端粒长度的测量方法,可利用少量的样品(~20ng)快速进行,但该方法仅提供了总端粒长度与单拷贝基因比率的相对测量值,而没有提供有关端粒长度分布的信息。由于在癌症中通常会发生非整倍性,因此qPCR在癌症研究中定量端粒的长度也是不准确的。另外,定量荧光原位杂交只能评估处于分裂中期的活跃分裂细胞;肽核酸杂交方法PHAST需要专用设备;而STELA方法也依赖于Southern杂交且十分耗时。

图:由STAR方法的设备捕获的放大图像,不同的荧光强度反映了单个端粒分子的长度变化

在这项最新研究中,由新加坡国立大学研究人员开发的STAR分析方法依靠数字PCR对样品进行分区,因此可以在纳升隔室中测量端粒重复序列的数量。据悉,研究人员使用Fluidigm的48.770数字芯片集成流体回路和Biomark HD系统开发了该检测方法。具体而言,PCR扩增导致PCR产物与端粒重复片段的初始长度或拷贝数成比例增加。PCR产物的增加反映在实时监测荧光信号所捕获的DNA结合染料的荧光强度变化中。研究人员指出,该测定法包括常规qPCR的其他变化,例如用EvaGreen替代典型的SYBR Green I染料以及退火温度和引物浓度的变化。此外,为了使测定提供绝对长度而不是相对长度,研究人员使用了不同数量的已知长度的合成端粒以生成标准曲线,进而可以根据该标准曲线计算其他端粒长度。

图:STAR方法工作流程

研究人员使用一组人类癌症细胞验证了STAR方法的有效性,并使用TRF和其他方法对其进行了分析。研究人员报告称,通过STAR测定测得的平均端粒长度与金标准TRF方法高度相关,这表明STAR测定是绝对端粒长度的可靠指标。他们补充说,STAR方法的处理时间不到三个小时。研究人员进一步将STAR分析应用于量化ECTR。ECTR是癌细胞使用基于同源重组的机制来保存其端粒的一种特征。ECTRs的数量可能反映癌细胞中端粒(ALT)交替延长的严重程度(与较差的预后有关),并且可以为治疗选择提供依据。进一步,新加坡国立大学研究人员与新加坡KK妇幼医院Amos Loh团队合作,使用STAR分析方法对四个临床小儿神经母细胞瘤样本进行了分析。验证证明STAR方法可有效诊断小儿神经母细胞瘤的ALT状况,可将其用作该癌症的有效预后指标。

总的来说,该研究团队开发的STAR方法可在3小时内测量多达48个样品的单个端粒的绝对端粒长度,所需的起始DNA量较低,不足1ng。此外,STAR测定法具有广泛的动态测量范围,因为它能够测量长度范围为0.2~320 kb的端粒长度。研究团队将该测定法应用于人类癌细胞系和人类临床样品中,并能够根据端粒长度分布准确检测每个样品的端粒维持机制。

Lih Feng Cheow最后总结道:“快速的工作流程、可扩展性和单分子分辨率的结合,使我们的系统在使用端粒长度分布作为疾病和人群研究的生物标志物方面具有独特性。它对于诊断临床时间尺度内的端粒维持机制,为患者确定个性化的治疗或预防策略方面具有重要作用。”据悉,新加坡国立大学团队正在寻求扩展其研究,并在医院环境中应用STAR分析平台,以帮助诊断与衰老相关的疾病。

参考资料:

1. Massively parallel single-molecule telomere length measurement with digital real-time PCR

DOI: 10.1126/sciadv.abb7944

2. Singapore Team Develops Digital Real-Time PCR Method to Measure Telomeres

https://www.genomeweb.com/pcr/singapore-team-develops-digital-real-time-pcr-method-measure-telomeres#.X0NpNXot1PY

3. NUS researchers develop new system for accurate telomere profiling in less than 3 hours

http://news.nus.edu.sg/research/new-system-profile-telomeres-less-3-hours

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本文由 测序中国 作者:陈初夏 发表,转载请注明来源!

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