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基于特异性抗体的高通量测序新方法CoolMPS™,华大智造发表最新研究成果

- 编者按 -更加准确和更长读长是高通量测序技术发展的重要方向,近日bioRxiv发布了华大智造团队的一项研究成果,这种被称为CoolMPS™的方法是一种创新性的基于碱基特异性抗体的测序化学技术。实验结果显示,该技术能够提升荧光信号强度,提高信噪比,使用天然碱基和特异性抗体降低了测序错误率并提升了读长。该技术的大规模商业化应用有望推动测序行业质量标准的更新升级,助力生命科学和医学研究。

在生物医学大数据的重要价值日益凸显的今天,大规模组学计划成为世界各国的重要战略布局,如何能够更准确、更快速、更低成本地开展基因测序变得愈发迫切,驱动着技术之轮飞驰向前。高通量测序诞生和发展的历史,镌刻着科学家和产业先驱们在“更准、更全、更快、更便宜”的道路上所作出的种种努力。近日,由华大智造联合浙江大学沃森基因组科学研究院等团队共同完成的一项研究成果于bioRxiv发布了预印本(https://doi.org/10.1101/2020.02.19.953307)。该研究向我们展示了一种全新的、基于抗体的高通量测序方法——CoolMPS™,并介绍了它相比于传统技术的一些突出的特性和优势。据悉,目前该技术已成功转产并推向全球市场,不仅为广大基因组学的研究者提供了更多选择,也有望推动高通量测序技术的加速发展。

那么,该技术包含着哪些独特的创新,它又如何克服传统基因测序方法的局限?故事的开头,要从大家最熟悉的A、T、G、C(组成核苷酸的碱性基团)开始说起……

一、传统方法的局限与CoolMPS™的创新

在目前最为流行的大规模平行测序(MPS)平台中,为了测定碱基类型,我们将荧光染料标记的四种可逆终止核苷酸(RTs)加入反应体系,进而读取荧光信号。然而,这种加工过的核苷酸不仅带来了额外的成本,也有可能在洗脱步骤出现部分荧光染料基团化学结构残留在新合成核苷酸链上的现象,这些残留的化学键——或者说“疤痕”——可能影响新合成链的柔韧性和聚合酶对链的持续延伸的结合效率及聚合酶的保真性,还有可能部分淬灭在下个循环上的荧光信号,从而影响测序的质量。换言之,这些经过加工的核苷酸,虽然为测序带来了便利,却也埋下了 “偏差”(bias)的种子

“清水出芙蓉,天然去雕饰。”我们能否利用未经修饰的天然碱基进行测序呢?在抗体技术的帮助下,这一想法成为了现实。作为一种新型的MPS测序体系,它借助未标记的RTs与四种荧光标记的、能与天然碱基特异性快速结合(30秒)的抗体的配合,得到了极为优异的表现。具体步骤如下:第一步,加入未标记可逆终止核苷酸;第二步,碱基互补配对完成后,加入荧光标记的,能与(上一步加入的)3'-阻断的核苷酸特异结合的抗体;第三步,洗脱多余的抗体,在基因测序仪上成像,进行碱基识别;第四步,洗脱抗体和3'-阻断基团,得到天然无疤痕的核苷酸,进入下一个循环(见图1)。

图1 CoolMPS流程

抗体堪称生命科学研究的“神器”,它的优势在CoolMPS™技术中也体现得淋漓尽致。概括来说有以下四点:

1. 信号强

每个抗体能结合多个荧光分子,碱基信号更强,相同拷贝数的DNB用CoolMPS™可以获得更高的信号和更高的信噪比,从而使测序更准确。图2显示了在多个循环中使用两种测序通用反应试剂(分别基于CoolMPS™方法和标准方法,即将荧光染料直接标记在ddNTP上)的信号强度比较,CoolMPS™的信号强度远高于传统高通量测序试剂。更强的信号也意味着,我们有机会在更低的起始量下进行测序,未来或可实现在更小DNB(例如<100nm)的超高密度DNB纳米阵列上进行MPS。

图2 测序时CoolMPS™的信号强度与标准方法(Standard MPS)的比较(a)及两种方法的预计错误率(b)

2. 避免了非天然碱基带来的荧光淬灭

在传统的高通量测序方法中,聚合的碱基上会留下多余的化学键(即前文提到的“疤痕”),可能会影响待测碱基上的荧光信号,进而影响测序的准确性。CoolMPS™方法中新合成链的碱基为天然碱基,不会因为碱基上的疤痕而影响荧光信号,最终获得更高的准确性和更长的测序读长。

3. 反应更完全,测序读长更长

DNA聚合酶在生物体内的底物是天然dNTPs。虽然经过突变体的改造,DNA聚合酶也能加碱基上有庞大荧光基团标记的dNTPs,但其反应效率远远不如加碱基上没有标记的dNTPs。此外每一轮反应接近100%的完成率也是进行更长读长的短读测序的必要条件,否则信号会呈现指数下降,产生测序错误。

为了探索CoolMPS™能否测得更长,研究团队进行了SE400的测序实验。Q值的分布如图5所示。前300个碱基的错误率仅为0.14%。如果增加每个DNB的拷贝数和每个抗体上带的染料分子,进一步减少lag和runon(*注:lag和runon是用来衡量测序反应是否完全的指标。lag是指测序进行到N位置时,其某些拷贝才反应到N-1位置的比例;而runon则指某些拷贝已反应到N+1位置上的比例),有望实现更高质量、更长读长的CoolMPS™测序,甚至可能达到Sanger测序的读长(例如500-700个碱基)。

图3 CoolMPS™ SE400的碱基Q值分分布随循环数的变化

4. 抗体已广泛用于诊断测试和治疗,对抗体本身的研究已经非常深入

有许多成熟的技术可以进一步帮助CoolMPS™方法的进一步优化,包括小分子抗体如ScFv或纳米抗体替代完整抗体等。这表明CoolMPS™还将具有更大潜力和可挖掘价值。同时,在成本控制方面,CoolMPS™也有着很大的潜力。

二、初露锋芒:CoolMPS™多场景应用数据

大规模并行测序中,测序读长超过100bp对下游的信息分析非常有用。文章首先展示了SE200测序的荧光信号强度、错误率随测序循环数变化的趋势,以及关键性能指标(错误率在185个循环之后增加很快,这是由于测到了接头序列,这些接头无法比对到人类参考基因组上)。

图4 SE200的信号强度(a)、错误率(b)和性能指标(c)

而对于目前使用最为广泛的双端测序(PE150)而言,研究团队使用大肠杆菌和人的样本进行测试,数据显示,Read1比对率> 99%,错误率分别为0.08%和 0.26%;Read2比对率约为 99%,错误率分别为 0.22%和 0.62 %。在过滤掉质量值少于10 的read后(分别约为 0.4%和 0.8%),错误率分别降为 0.06%和 0.24%。这些结果反映了CoolMPS™方法的准确性和可靠性。

图5 PE150测序信号强度(a)和关键性能指标(b)

除文章展示的测试结果之外,研究团队的其它测试也有助于我们了解CoolMPS™的特点。在一项使用MGISEQ-2000平台和CoolMPS™技术对FFPE标准品Horizon HD200进行靶向测序的实验中,基因组比对率>99%,Q30>92%,并且检测位点突变频率相对于平行进行的标准方法(StandardMPS)来说,与理论频率的相关性更高

图6 StandardMPS与CoolMPS™的突变频率与理论突变频率的相关性

包括上述测试在内的大量实验结果,为CoolMPS™的产品化打下了坚实的基础,目前该技术在华大智造测序平台MGISEQ-2000(DNBSEQ-G400)上已经可以可使用,并在一些研究中崭露锋芒。读者可以通过该公司官方网站(https://www.mgitech.cn/products/reagents_info/37/)做进一步了解。

三、小小抗体,大有玄机

CoolMPS™的优良表现,与高质量的抗体密不可分。首先,准确的测序要求抗体对 3’被可逆阻断的核苷酸具有特异性。为了证明每种抗体对每个碱基都是特定的,研究团队创建了DNB阵列,并与引物杂交,然后用一个可逆终止子延长一个核苷酸。结果显示表明,与4个标记抗体结合后,在单一成像场中DNBs群体的荧光强度不显示任何抗体交叉结合,说明抗体具有良好的特异性。

其次,抗体的结合需要 3'端有叠氮甲基阻断基团,这样能够确保抗体结合到我们希望读取的特定碱基上。图7显示了抗体与DNBs 孵育时的荧光强度。在前三个正常的cycle中,核苷酸上存在着叠氮甲基阻断基团,此时所有四种抗体都产生了强信号(400-600个计数)。从第四个cycle开始,每个cycle在抗体结合前都切除了3 '叠氮甲基阻断基团,此时无法检测到明显的信号。这表明除了碱基外,阻断基团对抗体的牢固结合也是至关重要的。抗体和碱基的牢固结合可能会阻止抗体与DNA中的其他靶标碱基结合,从而提升测序的准确性。

图7 左:抗体与DNBs孵育时的荧光强度; 右:标记抗体和标记RTs的荧光信号强度,前20个cycle使用碱基标记的核苷酸,之后60个cycle使用抗体标记,最后再使用碱基标记的核苷酸

研究团队通过反复的摸索和实验,证明只要4ug/ml的抗体,仅需30秒就能结合大多数新掺入的3’端可逆阻断核苷酸,从而产生足够的信号进行碱基检出。研究人员还发现,高pH值(>pH8)和高于55℃的温度可以有效地切除一定量的抗体,在切除试剂中加入未标记的RTs可以加速分离。不含RTs的缓冲液条件与叠氮甲基裂解反应可兼容。这意味着抗体切除能够和3 '阻断基团切除同时进行,大大提高时间效率。

最后,标记抗体可以比标记RTs得到更强的信号。为防止荧光淬灭,标记的RTs只能有一种染料附在一个碱基上。为了减少碱基“疤痕”的负面影响,通常标记只达到60-70%。而CoolMPS™的每个抗体可以标记多个染料分子,实验表明,相对于碱基标记的核苷酸,抗体检测产生了更强的信号,一些荧光团产生了比碱基标记高出300%以上的信号强度。增加强度的好处包括:在长时间的测序过程中,在高密度纳米阵列的低模板拷贝DNBs中得到足够的信号;减少暴露或实现更快速的成像。

在高质量抗体的帮助下,CoolMPS™在基因测序仪的二色成像系统上进行“四色”测序成为可能。我们知道,传统的四色荧光测序中,A、C、G、T 分别对应不同的四种荧光,这种测序方法受限于荧光染料的光谱重叠及对滤光片的要求。常规的二色荧光测序克服了四色荧光的缺点,仅利用光谱距离更远的两个荧光来识别两个图像中的四个碱基。但缺点是,为一个碱基分配一个空强度值,一个碱基是两种颜色的混合。这仍然可能导致碱基的重叠。CoolMPS™首先一次加两个荧光抗体,读取信号,去除;随后加入另外两个荧光抗体,读取信号,获得四个不同的图像(每个碱基一个)。也就是说,这种方法可以在配备二色成像系统的基因测序仪上达到“ 四色测序”的效果(4CS2CI)。测试结果表明, CoolMPS™测序引入的这种方法几乎消除了染料串扰,将G到C的错误降低了52.2倍,使得C的平均错误率极低(0.00045%),并且原始读取的G(0.00070%)的错误率,比标准4CS4CI CoolMPS™低一个数量级。

图8 利用CoolMPS技术分别在四色成像系统(4CS4CI)和二色成像系统(4CS2CI)的测序结果对比

四、展望:开拓大规模平行测序的新天地

通过对文章的解读,我们可以看到,基于抗体的CoolMPS™测序方法为急速发展的高通量测序技术开拓了全新的方向,优异的测试结果为我们揭开了基因测序技术实现跨越升级的美好愿景,激励着研究者们沿着这一思路进行更多探索和尝试。CoolMPS™试图从根本上改革传统测序方法中信号读取的局限性,大胆地使用荧光标记抗体来代替荧光标记的核苷酸,并在化学过程、信号读取、数据质控等多个层面进行了大量测试,体现了锐意创新和严谨求证的有机结合。

可以预见的是,这项新型测序技术将全面提升华大智造DNBSEQ系列测序系统的性能、质量、实用性和性价比,为基因组学研究和应用创造更多可能。随着CoolMPS™技术在DNBSEQ测序平台上的大规模使用,测序行业通用的质控指标(如读长、错误率等)有望在新技术的驱动下进一步升级,这也势必会带来更高的行业标准,北美乃至于全球测序市场的产业竞争格局也将迎来新的变化。日趋激烈的技术竞争推动着高通量测序的边界不断拓展,更多的生命科学和医学研究将因此而获益。

与此同时,我们也应清楚地认识到,CoolMPS™还有着广阔的提升空间,能否进一步减少信号损失和异相读取?能否继续提升化学反应的性能,增加信号的强度?在二色或一色成像仪系统上进行高精度的“四色测序”能否得到推广?众多问题呼唤着国内外研究者去回答,期待以上这些问题能够在不久的将来得到答案。实践是检验真理的唯一标准,希望包括CoolMPS™在内的基因组学领域的最新研究成果和前沿技术,能够激发出更多创新和更广泛的实践,助力基因测序为人类健康水平的提升作出更多贡献!

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本文由 测序中国 作者:戴胜 发表,转载请注明来源!

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