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高通量DNA甲基化测序,远比你想象的更为简单丨探究WGBS文库构建最新动态

DNA甲基化作为重要的表观遗传学调控机制在许多关键的生物学过程如发育及疾病的进展中扮演着重要的作用。在应用方面,表观修饰信号作为标志物,在无创产前筛查或单基因遗传病诊断中也初步展现潜力。另外,在Grail的大规模肿瘤早筛临床项目中,WGBS技术表现卓越;在国内,基准医疗、贝瑞基因的相关研究也是稳健推进,鹍远基因的某些产品也已上市。近些年,基于游离核酸的肿瘤液体活检技术更是将DNA甲基化的应用推向了新的浪潮。相对于基于芯片的传统检测手段,基于高通量测序的全基因组亚硫酸氢盐测序(Whole Genome Bisulfite Sequencing, WGBS)技术,可在单碱基的分辨率下对来自更多样本基因组中的甲基化位点进行准确的分析,既可以覆盖所有甲基化位点,还能够配合靶向技术检测低频甲基化信号,而在具体的建库流程中,亚硫酸氢盐转化后建库(Post-BS WGBS),已成为目前在业界受到广泛关注的一种主流方法。

在Post-BS方法中,Tailing建库严重影响测序时的碱基均衡,会造成整体测序质量降低。此外,还存在建库操作繁琐,建库时间长等问题。随机引物扩增的均一性仍然不容乐观。随着在肿瘤领域应用的不断深入,针对于诸如FFPE及ccfDNA等起始量低且片段完整性较差的样本,从前期的亚硫酸氢盐转化开始便会面临严重的效率低下问题,进而对后续的建库及测序质量带来严重的影响。

针对以上显著存在的问题,QIAGEN公司基于在甲基化研究领域的丰富经验,最新推出了一种全新的WGBS文库构建方案可实现对上述挑战的很好解决。从经EpiTect Fast系列等亚硫酸氢盐转化方法获得高效转化后(通常>99.5%)的DNA开始,无需额外的片段化过程,该建库方案便首先针对其中的单链DNA开始进行高效的双链DNA修复并在同一反应体系内同时完成相应的双链DNA的末端修饰过程,并无需纯化直接在同管内直接加入无需额外甲基化处理的普通文库接头,即可完成后续高效接头连接过程。随后,采用基于可耐受U碱基存在的超高保真低偏倚VeraSeq Ultra DNA聚合酶扩增体系进行较低循环数的文库扩增,为后续甲基化位点分析的高可信度提供了极为重要的保障。整体WGBS建库流程仅需约2.5小时便可完成,可兼容最低至(转化前)100pg的起始DNA用于高质量、高保真性、高产量的全基因组甲基化文库构建。

基于传统的WGBS文库构建流程由于建库环节中存在诸多的效率问题,通常会导致较低的文库产量及比对率,所以无法保证后续的测序结果和质量。这款全新的QIAseq Methyl Library Kit的推出则很好解决了这些传统技术的难题。该试剂盒可从来自多种起始样本最低100ng的DNA开始进行转化及建库,并获得极高的文库比对率。如下图所示,采用100pg-100ng的Jurkat细胞中提取的DNA经专门优化EpiTect Fast转化及QIAseq Methyl建库实验流程后进行测序,在不同水平的起始DNA中均获得了很高的比对率。

而针对于某知名品牌同等产品的比较结果表明,即便仅使用低于三分之一的起始DNA 量,QIAseq建库方案也能产生更高质量的reads、更为准确的鉴定结果以及更低的GC偏倚。

此外,值得一提的是QIAseq Methyl建库方案在可以应对极微量的起始DNA的基础上,针对较为特殊的疑难样本如高度片段化的FFPE、ccfDNA还提供了极为详细的独特优化实验操作过程。如针对不同样本、不同起始量的EpiTect Fast转化优化操作流程,帮助用户免去了对于此类特殊样本需要进行复杂条件优化的烦恼,具有极强的实际应用价值。如下图所示,采用QIAamp MinElute ccfDNA Kit对来自三位健康志愿者的血浆样本进行ccfDNA的提取并分别使用8~10ng ccfDNA根据相应优化的流程利用EpiTect Fast及QIAseq Methyl流程进行后续文库构建并完成较低深度测序,随后采用CLC Genomics Workbench软件中的Bisulfite Sequencing Plugin插件进行文库质控和比对分析。从结果可以看出,所有的ccfDNA样本均获得了较高的比对率及准确的甲基化位点鉴定,也反映出了极高的亚硫酸氢盐转化效率。

同样的结果也在FFPE样本中得到。采用10ng和100ng来自脾脏和肝脏的FFPE DNA样品通过相应的EpiTect Fast转化并完成相应QIAseq Methyl建库流程后,通过CLC Genomics Workbench内置的Bisulfite Sequencing Plugin插件也同样得到了类似的高质量测序比对及分析结果。

综上所述,QIAseq Methyl建库方案结合QIAGEN在DNA甲基化研究领域的丰富经验及全面产品线案,可为高通量甲基化测序带来更高的品质及使用体验,可针对几乎任何类型的样本来源完成从针对甲基化分析的前期样本采集与稳定、核酸提取、亚硫酸氢盐转化、WGBS文库构建、NGS数据分析以及基于PyroMark焦磷酸测序甲基化位点验证的完整工作流程。

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本文由 测序中国 作者:王迪 发表,转载请注明来源!

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