思考

NBT发文 | 全球9个实验室联合开展小RNA测序方案的综合评估

RNA测序越来越多的应用于不同样本类型的定量分析,如离体细胞、组织和液态活检中的microRNA、piRNA和snoRNA等。这些小RNA片段在癌症等疾病状态下会发生改变,可作为生物标志物帮助人们在早期阶段检测疾病。但由于存在多种RNA测序方案,不同实验室采用不同方案检测小RNA,会得到不同的结果。而且目前使用的小型RNA测序文库制备方法的准确性和重现性并没有得到系统的测试。

2018年7月17日,美国国立卫生研究院细胞外RNA通信联盟研究人员在Nature Biotechnology上发表了RNA测序的最新研究成果,来自该联盟9个实验室的研究人员评估了3种不同的小RNA测序商业试剂盒,以及Pacific Northwest研究所David Galas实验室开发的内部方法和该方法的不同改进方案。研究发现,用于小RNA测序的随机序列接头文库制备试剂盒,可能比固定序列接头常规文库制备试剂盒的检测偏差小。并且将固定序列与随机序列接头的文库构建方法结合,可以降低这种检测偏差。

由于分子尺寸差异较大,所以在同一样本中,用于检测mRNA的试剂盒不能用于小RNA测序。通常为了使小RNA更长,RNA分子末端添加接头,目前的小RNA文库制备方法主要分为两种类型:一种是添加已知固定序列接头,一种是添加随机序列接头。

该研究报道了9个不同实验室的联合检测结果,这些实验室都有各自独立的序列参考。试验中,各实验室分别检测了合成小RNA和人血浆衍生RNA样本,评估了3种采用固定序列接头的商业化文库制备方案,包括Illumina TruSeq,New England Biolabs NEBNext和TriLink Biotech CleanTag,以及6种实验室开发的随机序列接头方案及改进方案,包括PerkinElmer开发的Bioo Scientific NextFlex,2015年东英吉利大学研究人员开发的建库方案,Galas开发的内部方案等,其中Galas开发的方案也被称为4N方法。

试验流程设计

该研究的主要作者,密歇根大学Muneesh Tewari实验室Maria Giraldez博士表示,她的研究小组对利用RNA测序方法分析血液中的癌症生物标志物非常感兴趣。该研究项目的主要目的是从血液中分析RNA,为疾病早筛提供依据。因为与组织、细胞的样本不同,血液、尿液中RNA含量很小,研究团队对RNA测序也不甚了解,所以该团队决定先分析各种RNA测序方案,以便确定它们在血液和其他生物液体小RNA测序中应用效果。

研究团队共对377个小RNA文库进行了测序,还对由两组已知合成RNA组成的对照文库以及人血浆衍生RNA文库进行了测序。研究发现,不同测序方案对特异序列的存在识别偏差。在合成RNA文库的测序中,不同测序方案对16-25个核苷酸小RNA的回收率不同,并且观察到的偏差大于已知长RNA测序中存在的偏差。

尽管所有的检测方案都有一定的偏差,但Galas开发的4N方案偏差相对较小。因为在使用随机序列接头时,每个RNA分子都能获得相同的结合机会,能更好的反应样本内容。相比之下,固定序列接头会偏好结合某些序列,而对其他序列“不理睬”。如果某种含量很低的microRNA不被接头支持,最终构建的文库很可能就会漏掉这部分信息。例如,研究人员计算了读取序列的中位百分比,发现这些序列的读取比预期高10倍或者低10倍,使用固定序列接头的TruSeq、CleanTag和NEBNext方案的中位百分比在42%至62%之间,而4N方案则在3%至22%。

但在实际应用中,使用固定序列接头的商业试剂盒比4N方案应用更方便,属于用户友好型产品。而4N方案显得更繁琐乏味,这也是今后的研究设计需要考虑的问题。

PerkinElmer的NGS产品组合主管Arvind Kothandaraman表示,在售的随机序列接头小RNA试剂盒PerkinElmer,也针对PerkinElmer的Sciclone G3进行了自动化设计,提高了工作流程效率,并减少了变异性。他指出,该研究证明了减少文库制备过程中引入的小RNA测序偏倚的重要性。

目前Illumina和NEB的Biolabs尚未对该研究发表评论。

此外,研究人员发现对于相同的样本,只要严格按照操作程序进行,在同一实验室内部和不同实验室之间的重复试验中偏差一致。在评估各个标志物的丰度时,不同的文库制备方法产生了不同的结果,且测序方案造成的结果偏差可能大于实验室之间的差异。他们还证明,将固定序列与随机序列接头的文库构建方法结合,可以降低这种偏差。而且使用小RNA测序对样本中的微小RNA进行相对定量,在实验室和方法上是准确可重复的。

接下来,研究团队将对真实样本进行miRNA测序,将癌症与健康对照样本进行比较,寻找miRNA和血液中的其他循环小RNA。他们表示最有可能使用4N方案。

研究人员表示,无论使用哪种测序方案,都需要标准化。如果各个实验室都采用相同的实验方案,确保“每个小细节”都相同,那么结果变化不大,这样检测结果才能相互比较,也希望该研究成果能够为后续相关研究提供参考。

 

 

 

 

参考文献

1. Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling

2. Michigan Team Characterizes Biases in Small-RNA Sequencing Techniques

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