肝细胞癌-胆管细胞癌（H-ChC）是一种罕见的肝癌亚型，具有肝细胞癌(HCC)和肝内胆管癌(iCCA)的临床病理特征，占原发性肝癌的1-14.1％。目前，在单一肿瘤中HCC和iCCA成分共存的分子机制尚不清楚。

北京协和医院赵海涛教授、王文泽教授和桑新亭教授联合团队从基因组学与代谢组学角度，揭示了H-ChC的单克隆起源及明显的瘤内异质性特征。其结果对于H-ChC的临床诊断、预后和治疗提供了重要的信息。该成果于2018年3月1日在线发表于国际著名期刊《Nature Communications》（影响因子12.124）上。

在此项研究中，研究团队对75例肝癌患者（包括15例混合型H-ChC、32例HCC、28例iCCA）进行免疫组化分析，包括肝细胞样标志物（Hep和GPC3），胆管细胞样标志物（CK7和CK19）。其中选择了7例H-ChC样本分别进行肝细胞肝癌、胆管细胞癌成份及正常肝组织的显微切割，然后提取DNA进行全外显子测序。研究人员对测序结果进行了错义突变，拷贝数变异，驱动基因，高频突变基因，易感基因及乙肝病毒整合的分析，进行了克隆分析以进一步明确两种肿瘤成份之间的关系。为了进一步研究H-ChC的细胞起源，研究小组还对所有样本进行了免疫组化，标志物为（EpCAM和c-kit），然后根据EpCAM的表达情况进行了相关生存分析。

图1.患者选择和实验程序的流程图

研究人员通过形态学及免疫组化进一步确认了H-ChC的诊断，如图2a所示 ，b表示肝细胞标志物Hep和GPC3的表达，绝大多数HCC和H-ChC样品显示Hep或GPC3阳性（肝癌组分中包含93.8％的HCC和80％的H-ChC） 。相反，只有14.3％的iCCA样品具有肝细胞表达。同时，使用两个标准标记CK7和CK19检查胆道分化。100％的iCCA样品表现出胆管分化，CK7或CK19阳性染色，93.3％的H-ChC样品仅在iCCA组分中显示出这种染色模式（图 2a，b）。相反，25％的HCC样品表现出胆管分化。这些病理结果与这些不同亚型肝癌的临床特征一致，证实了原始诊断。

根据DNA降解程度最终入选了7例CHC患者进行了外显子测序。对于全外显子测序结果，我们将肝细胞肝癌和胆管细胞癌成份共有的体细胞突变定义为共有突变，而各自独有的突变则定义为独有突变。我们发现CHC样本中存在大量独有的体细胞单核苷酸变异（SNV）（33.1%－86.4%）及独有拷贝数变异（79.3%－97.3），这些结果表明H-ChC具有明显的肿瘤异质性，这与在临床中看到的HCC和iCCA组分之间明显的形态学差异保持一致。这提示H-ChC患者个体间差异，在精准测序指导下H-ChC患者靶向药物的选择更加精确和有效。

图3.错义SNV的分布。a肝脏漫画显示患者的肿瘤部位。b维恩图显示了每个H-ChC患者中H-ChC组分（红色圆圈）和iCCA组件（绿色圆圈）之间错义体细胞突变的关系。不同的数字表示相应样品的错义体细胞突变的数目，并且重叠区域是相同H-ChC患者的两个样品之间普遍存在的错义体细胞突变。

一方面，被HCC和iCCA样本重叠的普遍存在的错义SNV范围从29到108（图 3）。此外，在给定的H-ChC中，iCCA的突变谱与HCC的突变谱几乎相同（图 4a）。这些数据表明在HCC和iCCA中存在大量共有突变，提示了H-ChC的单克隆起源。

图4.H-ChC样品中的突变谱和突变特征

克隆分析也进一步支持了该结论：研究团队使用体细胞SNV和考虑了CNV的体细胞突变构建了系统发生树（图5a） 。结果显示所有H-ChC的HCC和iCCA组分中的躯干的不同长度，这表明H-ChC的单克隆起源（图5a，c）。

图5

每个H-ChC内的错义突变和癌细胞分数比较。一个具有不同杆Heatplot表示的错义突变的各种分布包括体个SNV和H-CHC内插入缺失。普遍存在的非同义体细胞突变（干）（蓝色条）和独特的非同义体细胞突变（分支）（HCC绿色条和iCCA粉红色条）的比例揭示了单个H-ChC中两个肿瘤样品的关系。部分驱动突变标记在进化树的树干和分支上。b二维散点图显示肿瘤的HCC和iCCA组分突变的癌细胞分数（CCF）。从每个H-ChC样品计算不同的簇。脱离轴的簇表示两种肿瘤组分中的突变。轴上的簇显示HCC或iCCA组分中的突变。c该表显示不同肿瘤组分中的错义突变。

另外一个很大的疑惑就是为何单克隆起源的混合型肝细胞癌－胆管细胞癌能够演化为具有明显不同的肝细胞肝癌和肝内胆管细胞癌成份的肿瘤。我们认为其可能与干细胞及细胞分化相关。因此研究团队对肿瘤的突变基因与干细胞及细胞分化之间的关系进行了深入的数据挖掘。研究结果发现一些突变的基因，如VCAN, ACVR2A及FCGBP等与干细胞状态的维持及分化相关，参与了干细胞多能性调节通路及WNT，Notch通路，这些突变基因可能导致了混合癌中肝细胞肝癌和胆管细胞癌表型的分化。

再者，不同的肝癌类型EpCAM表达情况差异明显，其中肝混合细胞癌80%的阳性表达，CK19(+)及CK19(-)的肝细胞肝癌阳性表达分别为66.7%和17.2%，肝内胆管细胞癌为71.4%。生存分析表明EpCAM与肝癌患者的预后呈负相关关系。

本项研究通过全外显子测序手段，揭示了H-ChC的单克隆起源，其可促进原发性肝癌基于肿瘤细胞起源的分子分型。再者，H-ChC明显的肿瘤内部异质性鼓励我们进行多区域取样测序从而发现肿瘤发生过程中共有的驱动突变基因，从而让靶向药物的筛选变得更加精准而高效，为H-ChC的精准医疗提供了新的思路。

参考文献：

Whole-exome sequencing reveals the origin and evolution of hepato-cholangiocarcinoma.