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Nat Biotechnol发表“双重读取纳米孔”研究成果,有望提升单分子纳米孔测序精度

基于生物纳米孔的单分子长读长DNA测序技术具有快速和高通量的优点,但一直以来在同核苷酸延伸中识别准确性却有所降低。近日,一项由布鲁塞尔自由大学(VUB)和Oxford Nanopore Technologies公司研究人员开展的最新研究表明,一种具有两个可让DNA穿过的收缩结构的新型蛋白质纳米孔或可提高某些均聚物区域的测序准确性。

据悉,新的双重读取纳米孔是介于大肠杆菌CsgG纳米孔(Oxford Nanopore Technologies几年前从比利时获得许可)与另一种大肠杆菌蛋白CsgF的肽段(有助于形成第二个狭窄)之间的复合体。本周二,由VUB结构与分子生物学教授Han Remaut领导的研究人员在Nature Biotechnology杂志中发表了该复合物的低温电子显微镜结构,论文题为“A dual-constriction biological nanopore resolves homonucleotide sequences with high fidelity”。他们还表明,重收缩孔提高了长达8个核苷酸的均聚物(特别是较长核苷酸)的一致性准确度。   

论文通讯作者Han Remaut介绍,他对纳米孔测序的关注源于其对细菌细胞表面蛋白,特别是对CsgG的关注。该蛋白形成跨膜通道,并负责将细菌的淀粉样蛋白卷曲分泌到革兰氏阴性细菌的外膜外。2014年,其研究小组发表了大肠杆菌CsgG的X射线结构。“通过观察这个通道,我们发现这个通道具有的特点可能会适用于纳米孔传感应用。”他进一步解释说,特别是通道在其中心具有明确定义的收缩,当分子通过孔时,该收缩会调节电流信号。该文章发表后,Oxford Nanopore获得了该团队专利的使用授权,将CsgG及其衍生物用于传感应用,并开始了双方的合作。2016年早些时间,Oxford Nanopore宣布将采用R9新型纳米孔化学试剂,并称其为大肠杆菌CsgG的工程版本。

事实上,虽然R9纳米孔在一定程度上改善了野生型CsgG的测序性能,但仍需要进行更多努力以准确地识别更长的均聚物。Han Remaut表示:“当均聚物通过纳米孔通道时,信号中的信息较少,因此,从5聚体均聚物开始,其识别准确性开始下降。”

Han Remaut团队在新型双重收缩孔中的工作来自于对curli分泌通路的兴趣,其中还涉及与CsgG孔相互作用的另外两种蛋白质:CsgE和CsgF。在膜的细胞外侧发现的CsgF是卷曲素纤维分泌与组装之间的耦合因子。当研究人员使用低温电子显微镜解析了CsgG和CSGF的复合体结构后,他们发现,CSGF的N末端区域结合在CsgG的β桶内部,并在CsgG收缩入口上方约3纳米处形成第二个颈缩。他们推断,第二个颈缩口或许可以帮助解决均聚物的碱基识别问题。“当均聚物通过第一个颈缩时,碱基都是相同的碱基,因此电信号的调制很小。”Han Remaut解释说,“而如果有了第二个颈缩,它与第一个颈缩之间的距离是固定的,那么你将获得来自3nm外任何一个碱基的信号。因此,如果你想要的话,你将获得来自两点的读取信息而不是一个。”

Han Remaut

进一步,研究人员还确定了仅CsgF的N端部分(一种被称为FCP的肽)仍与CsgG以及Oxford Nanopore开发的R9孔形成紧密而稳定的复合物。他们还表明,该复合物仍能捕获和转运单链DNA,并产生来自于两个颈缩处的电信号。接下来,该团队将FCP与Oxford Nanopore目前用于测序的R9衍生物之一结合起来,以查看添加第二个颈缩是否可以帮助提高均聚物中碱基识别的准确度。他们发现,使用长度为3~9个核苷酸不等的合成poly-T寡核苷酸,对于5聚体到9聚体,与R9相比,R9-FCP的单分子读准确性得到了提高。但是对于3聚体和4聚体,R9孔表现的更好。Han Remaut介绍说:“从5个核苷酸开始,R9的碱基识别开始遇到困难,但双重收缩孔的识别性能将至少维持到9聚体均聚物为止。”

接下来,他们在大肠杆菌基因组DNA中测试了R9-FCP和R9纳米孔,发现对于长度不超过8个核苷酸的均聚物,R9-FCP数据比R9数据具有更好的一致性准确度。例如,对于8聚体,R9的一致性准确度下降到85%,而R9-FCP仍然达到95%。研究人员还表示,由于大肠杆菌基因组只有很少的长度超过8个聚体的均聚物,因此研究人员无法通过良好的统计数据测试更长的同聚物的识别性能。

但值得关注的是,本篇Nature Biotechnology论文发表后,也有学者发表了与Han Remaut研究团队不同的观点。

华盛顿大学研究人员Jens GundlachJens Gundlach就表示:“我觉得这些结果很有趣,但我并不完全相信对CsgG的这种修饰所带来的好处。”其研究小组发表了利用MspA孔进行的精子纳米孔测序工作。原因之一在于,引入第二颈缩会导致纳米孔产生的离子电流信号比R9孔小得多。此外,在短的合成poly-T上,R9-FCP孔的性能较R9差。尽管对于较长均聚物它的性能优于R9,但仍然会出现错误。Jens GundlachJens Gundlach认为,总的来说,使用双重读取孔的想法是有缺陷的。“你只是在测量一个变量,即离子电流,因此无法区分放置在其中的两个读取头。你不知道是哪个变量修改了电流。” 相反,这个信号将来自两个颈缩中的多个碱基,从而“将信号洗掉了,因此该孔的总体测序能力很差”。

而另一个潜在担忧则来自孔复合物的稳定性。“我们发现该复合物的使用寿命超过24小时,并且某些孔超过48小时。”Han Remaut表示,“要确保孔具有与R9相似的寿命,这也是工程上必须注意的一点,这并不是你为双重收缩孔需要付出的代价。”

不过,Han Remaut也表示R9-FCP孔仍有改进的空间,论文中的数据只是来自“一个非常早期的原型,但是具有非常有潜力的特性”。例如,FCP和R9仍可以进行工程设计以改善通道的性能。此外,他和他的同事使用的碱基识别软件是在R9上进行训练的,而不是在双缩孔上进行的。他说:“这些仍然是需要进一步改进的领域,直到能够真正测试出这种双重收缩通道能走多远。”

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本文由 测序中国 作者:陈初夏 发表,转载请注明来源!

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