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Science Advances | 推翻已有结论!尚无证据支持哺乳动物中存在6mdA表观遗传修饰

DNA甲基化是哺乳动物的关键表观遗传机制,其中5-甲基胞嘧啶(5mC)是最常见的DNA修饰之一。5mC对于哺乳动物的早期发育至关重要,在谱系特异性基因沉默、基因组印迹和抑制重复元件中起着核心作用。与之相反,在原核生物中5mC是罕见的,而N6-甲基腺嘌呤(6mdA)是其DNA甲基化的常见形式。

6mdA是细菌限制性修饰系统的基本组成部分,可使原核生物区分良性宿主DNA和潜在致病性非宿主DNA。目前在哺乳动物中缺乏已知的限制性修饰系统。近年来,CellNatureGenome Res有多项研究报道,6mdA也存在于哺乳动物中,如小鼠胚胎干细胞、人类神经胶质瘤细胞。但仍有研究显示该结果存在不确定性。

近日,瑞典Linköping大学科学家发表的一项研究成果推翻了这一结论。研究团队在Science Advances发表文章“No evidence for DNA N6-methyladenine in mammals”。结果显示,迄今为止发表的研究证据不足以证明在哺乳动物中存在6mdA这种细菌表观遗传修饰,此前哺乳动物细胞存在6mdA的研究很可能被污染。

来源:Science Advances

最初,为了进一步阐明6mdA在哺乳动物细胞谱系中的作用,瑞士研究团队在体外将人幼稚T辅助细胞(NTH)分化成T辅助细胞亚群(TH),利用已发表数据进行了全面生物信息学分析和新颖的实验。令人意外的是,他们发现TH细胞分化过程中6mdA的丰度并没有全局变化,并观察到6mdA在分化T细胞中的水平与非甲基化全基因组扩增DNA相同(图1A),表明在人T细胞中不存在可检测水平的6mdA。此外,研究人员在所有小鼠或人类组织中均未能检测到6mdA,这些样本均与缺少6mdA的全基因组扩增DNA对照中的信号相似(图1B)。这一发现与此前关于哺乳动物存在6mdA的结论相反,引起了研究团队的注意。

图1.免疫印迹显示在体外分化过程中人CD4+ T细胞(A)、人和小鼠原代DNA(B)中相对6mdA丰度。培养细胞系(上),全基因组扩增对照(中)和支原体污染(下)。来源:Science Advances

随后,研究团队分析了从六个人类细胞系中分离出的DNA中的6mdA,并鉴定出两个具有高于背景噪声水平的6mdA水平的细胞系。出乎意料的是,两种单独的T细胞系培养物具有不同的6mdA水平,表明此前研究观察到的6mdA信号并非细胞类型本身所固有的。经过进一步分析,研究团队证实两个6mdA水平升高的细胞系已被支原体属污染。(图2)支原体属一种常见的富含6mdA的细菌细胞培养物。当研究人员用支原体特异性抗生素处理细胞系时,发现6mdA信号降低为全基因组扩增阴性对照水平,证实6mdA阳性信号来源于支原体属污染。

图2.使用抗体试剂盒验证支原体阳性,虚线为支原体阳性阈值。来源:Science Advances

由于未能在任何未污染的哺乳动物DNA中检测到6mdA,研究团队试图验证已有方法的敏感性。因此,研究团队分析了此前在哺乳动物细胞中通过DNA免疫沉淀测序、质谱和单分子实时测序定位或检测6mdA的研究,并发现每种方法都有局限性或缺陷。他们意识到,通过这些技术检测到的6mdA'信号'只是噪声。但由于一些复杂的技术问题,几种方法中的背景噪声不是随机的,而是呈现出“真实”的信号。这使得表观遗传标记的假阳性发现率很高,也暗示着哺乳动物细胞中可能并不存在6mdA这种修饰现象。例如,对已发表MS数据的分析显示,即使在相同物种和细胞类型中,检测到的哺乳动物6mdA丰度也存在巨大差异(10到1000倍)。(图3)

图3.对已发表九项独立质谱研究中人类、小鼠、猪和大鼠DNA中6mdA丰度数据的分析,来源:Science Advances

该研究表明,RNA和细菌污染、抗体交叉反应性和其他技术限制已导致人们在哺乳动物DNA中错误地识别6mdA。随着DNA和RNA修饰家族的不断壮大,未知表观遗传修饰的丰度越来越低,即使使用多种互补方法,也存在错误发现的可能。因此,研究团队建议在未来的罕见DNA修饰研究中,使用修饰和未修饰的基因组DNA标准品作为最低标准要求,并在使用前进行更全面地抗体特异性验证。

文章通讯作者Colm Nestor表示:“在研究罕见的DNA现象时,必须非常小心地选择使用哪种方法,并考虑是否真正在衡量存在的事物。我们认为,迄今为止发布的研究证据不足以支持哺乳动物细胞中存在6mdA表观遗传修饰。”

参考资料:

1.No evidence for DNA N6-methyladenine in mammals, 18 Mar 2020. Science Advances

https://advances.sciencemag.org/content/6/12/eaay3335

2.Researchers Find No Evidence to Support Presence of Bacterial Epigenetic Mark in Mammals

https://www.genomeweb.com/genetic-research/researchers-find-no-evidence-support-presence-bacterial-epigenetic-mark-mammals#.XndxnDMpj2c

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本文由 测序中国 作者:戴胜 发表,转载请注明来源!

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