目前，全球已累计确诊80,000多例COVID-19患者。新冠病毒与17年前爆发的SARS冠状病毒非常相似。但新冠病毒具有更高的传染性，没有任何症状的受感染个体仍可以将病毒传播给他人。因此，我们迫切需要开发一种快速、准确的检测方法，以有效地识别早期感染患者，及时治疗并控制疫情扩散。

2020年2月24日，沈阳化工大学应用生物学研究所所长尹秀山博士团队开发了一种基于逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）技术的新冠病毒检测方法iLACO，可在15~40分钟内快速检测新冠病毒。同时，研究团队通过BLAST比对11种相关病毒，包括7种相似冠状病毒，2种流感病毒和2种其他冠状病毒的序列，以确保iLACO检测的特异性。该研究发布在medRxiv上，文章题为“Rapid colorimetric detection of COVID-19 coronavirus using a reverse tran-scriptional loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) diagnostic plat-form: iLACO”。

图1.文章发布在medRxiv

对于RNA病毒感染，尤其是急性呼吸道感染，通常使用RT-qPCR检测致病病毒。基于RT-qPCR的方法也已被全球疾病控制与预防中心及其他相关部门广泛使用。但RT-qPCR仍具有许多局限性，例如需要高纯度的样本，实验室仪器昂贵，反应时间较长（至少2小时）。此外，RT-qPCR需要专业人员和先进设备进行样本处理，限制了其实际应用。逆转录环介导等温扩增技术RT-LAMP，是近年来流行的病原检测方法，可直接完成RNA目的基因检测，具有快速、准确、仪器要求低、检测结果肉眼可见的优点。

尹秀山团队通过优化RT-LAMP开发了针对新冠病毒的iLACO方法，其设计的6种引物可特异性鉴定ORF1ab基因靶标的八个不同区域，并成功扩增新冠病毒基因。当新冠病毒RNA与反应混合物中的pH指示剂耦合时，可以通过观察颜色的变化获得检测结果。阳性反应可导致反应混合物的pH降低，pH指示剂从粉红色变为黄色，阴性反应仍保持粉红色。

图2：分别优化RNA和cDNA样本的iLACO反应时间。A和B.五组特异性引物对，可检测RNA和cDNA样本15种分钟（A）和20分钟（B），NC为指阴性对照。C.琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物；D.在用水浴或培养箱温育的1.5ml试管中iLACO反应的信号，PC为含有新冠病毒RNA的阳性对照。来源：medRxiv

为了解iLACO的检测限，研究团队准备了多个反应，包括合成ORF1ab基因的系列稀释液（从1,000,000到10拷贝）。结果显示，iLACO非常敏感，可检测低至10个拷贝的ORF1ab基因。经比较，iLACO检测的灵敏度与基于Taqman的qPCR检测方法相当，可检测相当于10个拷贝的新冠病毒的合成RNA。反应时间从15~40分钟不等，具体时间取决于收集样本中的病毒载量。

图3. A：iLACO检测极限评估；B：新冠病毒RNA样本（1:10稀释）在37分钟内检测到阳性信号。来源：medRxiv

随后，研究团队利用iLACO评估了2020年沈阳市疫情爆发期间的43个临床样本，这些样本已经过RT-qPCR初诊。结果显示，上样量为2μl时（RNA浓度范围为0.2-47 ng /μl），97.6%（42/43）的样本在孵育40分钟后显示出一致的信号，只有一个样本在50分钟后颜色保持不变。经分析，发现低剂量病毒会引起假阴性或自发性阴性信号。

值得注意的是，目前，RT-qPCR检测大多使用5µl样本量。那么增加样本量是否有助于iLACO检测？结果显示，此时的检测结果不一致。对此，研究人员认为，或许是由于RNA提取时，RNA稀释缓冲液中存在Tris或EDTA所致，这可以通过调整所用缓冲液的浓度来优化。

此外，研究人员表示，通过优化引物浓度，高剂量病毒的总反应时间会进一步缩短。优化后的iLACO不仅可以检测新冠病毒的RNA，也可用于cDNA样品。该新检测方法的准确性、简便性和多功能性表明，即使在没有专门的分子生物学设备的情况下，iLACO也可以方便地用于新冠病毒的检测控制，但仍需临床验证。

此前，南开大学与国内多所高校及相关生物医药企业的科研团队联合攻关，成功研制出新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM/IgG抗体联合检测试剂盒。其中的快速测试卡可在15分钟左右完成检测，具有操作简便、容易判读、灵敏度高等优势，提高了抗体检测的灵敏度。

相信随着更多高效、准确、便捷的新冠病毒检测方法的开发，我们将有望突破现有核酸检测方法对人员、场所的限制，缩短检测时间，推动诊断前移下移，实现疑似患者的快速诊断和密切接触人群的快速筛查。

参考资料：

1.Rapid colorimetric detection of COVID-19 coronavirus using a reverse tran-scriptional loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) diagnostic plat-form: iLACO

https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.02.20.20025874v1

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