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AJHG | 卢煜明教授团队成功构建cfDNA片段化模型,揭示DNA片段化过程关键步骤

在癌症等疾病的诊断和预后中,cfDNA可提供丰富的分子信息。虽然cfDNA通常用作非侵入性生物标志物,并且已知以短片段的形式循环,但是控制cfDNA片段化和分子分布的生理因素仍然知之甚少。已有研究表明,cfDNA的片段化并非随机过程,DNASE1L3核酸酶与血浆中cfDNA的大小分布有关。

近日,香港中文大学卢煜明教授团队的最新研究构建了cfDNA片段化模型,揭示了有关典型cfDNA片段化的两个主要步骤:(1)DFFB、细胞内DNASE1L3和其他凋亡核酸酶对细胞内DNA片段化;(2)血清DNASE1L3、DNASE1进行细胞外DNA片段化,将cfDNA降解为短T端片段。这一机制定义了完整的细胞DNA如何被剪切成血液中的循环小片段。相关研究已发表在《美国人类遗传学杂志》(AJHG)上,解决了有关此过程的此前未解决的问题,可能有助于优化当前的液体活检方法,以及为血液基础医学检测开发新方法。

在这项最新研究中,研究团队利用核酸酶缺陷小鼠模型,探索了三种酶DNASE1、DNASE1L3和DNA片段化因子亚基beta(DFFB)的作用,建立了一个可以描述cfDNA片段化过程的模型。通过对小鼠血液样本进行测序,并比较每种核酸酶缺陷型小鼠与野生型小鼠中的cfDNA分子末端,证明研究中使用的核酸酶都具有特定的切割偏好,提示了cfDNA片段化的过程。

图:研究方法概述,来源:AJHG

该研究依赖于一种在EDTA中孵育全血的方法,诱导体外凋亡细胞死亡,并模拟cfDNA片段化和在实际生物体中的溶解过程。研究人员通过该方法处理并测序正常小鼠的血液,结果显示较长的cfDNA分子富集了A末端片段,特别是 A< >A, A<>G, and A< >C片段,在200bp和400bp中具有很强的核小体周期性。

与之相反,来自DFFB缺陷小鼠的血液中则没有这种富集现象。研究人员认为,这意味着DFFB可能与产生这些A末端片段有关。通过分析,此前的研究成果可支持这一假设,即DFFB在凋亡过程的DNA片段化中起主要作用。

酶的表征研究表明,DFFB在开放的核糖体间DNA区域中可产生钝的双链断裂,并且此过程优先于A和G核苷酸。这种仅在核糖体间接头区域进行钝性双链切割的特征解释了核糖体中A <> A,A <> G和A <> C片段的形成。

在确定了DFFB的作用后,研究团队又进行了深入分析,因为实际观察中的典型cfDNA与EDTA孵育产生的cfDNA仍然有很大差异。与观察到的A端富集相反,所有典型cfDNA片段都趋于获得C端。因此,这一过程可能涉及一种或多种其他核酸酶,在A末端片段释放后完成后续修饰。

图:典型cfDNA片段首选C末端,来源:AJHG

研究发现,在DNASe1L3缺陷小鼠中C端片段占优势。研究团队继续研究了在释放初始DNA片段后,该酶的活性是在细胞内还是在循环系统中发挥作用。在试验中,研究团队发现了DNA片段化两步过程的证据:(1)DFFB、细胞内DNASE1L3和其他凋亡核酸酶对细胞内DNA的裂解;(2)通过血清DNASE1L3进行细胞外DNA片段化。在这两种情况下,DNASE1L3的活性似乎都发挥了作用。随后,研究团队还分析了第三种酶DNASE1在DNA片段化中的可能作用。

此前,研究人员发现cfDNA片段大小分布在DNASE1缺陷小鼠和野生型小鼠之间似乎没有差异。通过利用肝素模拟体内蛋白酶的功能,研究团队发现,野生型小鼠和DNASE1缺陷型小鼠的血液样本中T端片段增加,主要集中在亚核苷酸大小的50-150bp片段中,表明DNASE1可以产生短于<150bp的片段。

研究团队认为,该研究模型包含了与cfDNA产生有关的许多关键核酸酶,同时体外孵育系统可能无法完全呈现体内的复杂过程,该模型仍需进一步完善。例如其他潜在的凋亡核酸酶包括:内切核酸酶G、AIF、拓扑异构酶II和亲环蛋白等。在建立DNA片段化模型的过程中,研究人员还获得了可能干扰该过程的重要信息,包括样本在试管中的存储时间以及是否暴露于肝素中,某些条件有望大大改变样本的cfDNA片段分布。但不了解这些潜在的影响因素并不能阻止人们利用cfDNA片段化模式开发预测方法,用于非侵入性产前检查和癌症。

图:cfDNA片段化模型,来源:AJHG

综上所述,cfDNA片段首先在DFFB、细胞内DNASE1L3和其他核酸酶作用下在细胞内产生,然后在DNASE1L3和DNASE1的作用下在细胞外断裂,进而通过体内蛋白水解,DNASE1可以进一步将cfDNA降解为短T端片段。研究团队认为,该研究明确地将独特的核酸酶作用与观察到的cfDNA片段末端谱联系起来,阐明了这些片段产生方式的基本生物学特征和过程。

卢煜明教授表示:“我们知道cfDNA是短片段,但对这些片段的产生方式知之甚少。该研究逐步分析了负责产生DNA片段的多种核酸酶,为cfDNA检测打开了新的应用场景。在了解DNA断裂的发生过程后,研究人员也许能够找到异常断裂与特定病理或疾病状态之间的新联系。此外,由于cfDNA片段化已经开始用于各种癌症早期检测方法的开发,因此有关此过程的生物学信息可有助于验证这些方法的准确性。”

约翰·霍普金斯大学的Viktor Velculescu在最近的一次科学会议上也提到了相关需求,描述了其团队开发的通过分析cfDNA片段模式以检测早期癌症的方法。Velculescu指出,此类方法的全面技术验证面临的挑战是缺乏模型。这一最新模型描述了哪些核酸酶参与基因组片段化,以产生cfDNA。

核酸酶具有病理学后果的畸变可能反映在异常的cfDNA谱中。cfDNA片段化模型有助于将该正常过程的变化与其他疾病或病症联系起来。此外,通过分析cfDNA片段化以获得表观遗传和遗传信息,在疾病诊断中具有应用前景 。

参考资料:

1.The Biology of Cell-free DNA Fragmentation and the Roles of DNASE1, DNASE1L3, and DFFB, AJHG,2020

https://www.cell.com/ajhg/fulltext/S0002-9297(20)30008-2#

2.Study Uncovers DNA Fragmentation Processes, Providing New Insight for Liquid Biopsy Efforts

https://www.genomeweb.com/liquid-biopsy/study-uncovers-dna-fragmentation-processes-providing-new-insight-liquid-biopsy-efforts#.XkCnMXaAQkM

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本文由 测序中国 作者:陈初夏 发表,转载请注明来源!

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